油菜種子聯合降解菌對多環芳烴污染土壤的修復*

趙琦慧 李法云 吝美霞 石 潤

(1.上海應用技術大學生態技術與工程學院，上海 201418；2.上海城市路域生態工程技術研究中心，上海 201418；3.美麗中國與生態文明研究院(上海高校智庫)，上海 201418；4.湖南農業大學資源環境學院，湖南 長沙 410128)

在我國長三角、珠三角和環渤海區域石化產業分布密集，形成了三大石化產業集群。石化產業可導致大量多環芳烴(PAHs)排放[1]。據報道，排入環境的PAHs大部分進入到土壤環境中[2-5]。因此，受PAHs污染土壤迫切需要有效修復。

植物-微生物聯合修復技術可以綜合植物修復與微生物修復的優點[6-8]。有研究將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)與羊草(Leymuschinensis)聯合修復PAHs污染土壤，發現睪丸酮叢毛單胞菌可以在降解后期顯著提高菲的降解效率，但對萘和苯并芘的降解效率只有小幅提高[9]。另有研究表明，固定化技術可能會提高微生物的環境適應能力，抵抗環境毒性，從而可能會對污染物的降解效率有所提高[10-11]。

本研究系統地研究了油菜(Brassicarapavar.chinensis(L.) Kitam.)種子(包括包衣和不包衣)和石油烴降解菌單一或聯合修復對PAHs污染土壤的影響，并考慮了種子載體固定化降解菌，以期為構建植物與微生物共修復體系提供更多支撐和依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

清潔土壤采自上海應用技術大學植物園，pH為6.65。PAHs污染土壤采自遼河油田，pH為8.92，PAHs質量濃度為308.69 mg/kg。采集的土壤去除石塊、動物殘體和植物根系等雜質后過2 mm篩，備用。

作為填充材料的生物質炭由黃花菜秸稈在 500 ℃下炭化1 h后過0.075 mm篩制備得到。油菜種子來自湖南農業大學。包含假單胞菌(Pseudomonasadaceae)、芽孢桿菌(Bacillus)、微球菌(Micrococcus)、乳桿菌(Lactobacillus)、假絲酵母(Candida)、產堿桿菌(Alcaligenes)的石油烴復合菌劑來自安徽全民環保科技有限公司。蚯蚓糞有機肥來自上海溫興生物工程有限公司。

1.2 實驗設計

種子載體固定化降解菌制備：以10 g/L海藻酸鈉(SA)作為包埋劑、20 g/L CaCl2作為交聯劑、100 mg/L萘乙酸(NAA)作為生長調節劑、10 g/L聚乙烯醇(PVA)作為保水劑、5 g/L生物質炭作為填充材料形成混合膠狀液體；將混合膠狀液體與復合菌劑均勻混合；經次氯酸鈉消毒的油菜種子包埋在其中，用吸管吸取包埋種子滴入CaCl2溶液，在冰水浴中固定2 h，形成種子載體固定化降解菌。若不加復合菌劑形成的就是包衣種子。

清潔土壤與污染土壤混合配制成PAHs質量濃度為44.29 mg/kg的實驗土壤。稱取600 g實驗土壤于花盆(高12 cm、直徑13 cm)中，調節土壤含水率為60%，放置于上海應用技術大學植物園玻璃溫室。實驗設置5個處理，T1種植油菜包衣種子，T2在土壤中只接種復合菌劑，T3種植油菜包衣種子并在土壤中接種復合菌劑，T4接種油菜種子載體固定化降解菌，T5種植油菜種子并接種復合菌劑，所有實驗組均施用土壤質量分數5%的蚯蚓糞有機肥，不進行任何處理的實驗土壤作為對照處理(見表1)。第50天收取植物，并采集實驗土壤，風干過篩供污染物含量分析。

表1 實驗設計的不同處理

1.3 測定指標及方法

植物生理生長指標：油菜收獲前測量葉長、葉寬；用LI-6400便攜式光合作用測量系統測定光合速率和蒸騰速率；在葉片上取直徑為1 cm的圓片3片，在95%(體積分數)乙醇中避光浸泡至完全脫色(一般24 h)，分別在470、646、663 nm用分光光度法測定類胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b含量。油菜收獲后用蒸餾水洗凈，擦干后稱生物量，同時測量根長、莖長。

土壤pH的測定：稱取10.0 g風干土壤于50 mL離心管中，加入25 mL蒸餾水，以180 r/min振蕩5 min后用pH計測定上清液pH。

PAHs的提取和分析參照《土壤和沉積物 多環芳烴的測定 氣相色譜—質譜法》(HJ 805—2016)，索氏提取土壤中的PAHs后過硅酸鎂小柱凈化，用Agilent 7890B/5977B氣相色譜—質譜聯用儀測定PAHs成分和含量。

1.4 數據分析方法

采用SPSS 16.0進行單因素方差分析(P<0.05)，顯著性檢驗采用鄧肯(Duncan)法，數據用不同小寫字母標注表示差異顯著，用相同小寫字母標注表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 油菜的生理生長情況

從表2比較T5和T3發現，T3比T5生物量顯著增加了21.62%，說明包衣處理后的種子從包衣材料中可以獲得更多營養物質，外殼保護又減少了污染物對其毒害作用，而T3比T5根長顯著減少了13.48%，進一步說明未包衣的種子需要伸長根長來獲取更多營養物質。T3與T1相比，接種復合菌劑后由于對污染物的降解作用使得葉長、葉寬、莖長、根長和生物量都有所增加。比較T4和T3發現，將降解菌固定化處理后，葉長、葉寬、莖長和生物量顯著減少。

表2 油菜的根莖葉生長情況

由圖1可知，無論是光合速率還是蒸騰速率都是T3最大。有機污染物對植物具有抑制效應，接種降解菌后由于降解菌可以降解PAHs，因此光合速率、蒸騰速率明顯提升了，并且種子包衣處理后的植株光合速率與蒸騰速率高于裸露種子發育的植株，說明包衣處理有利于種子萌發及植株的生長發育，但將降解菌固定化會影響降解菌效果發揮。

圖1 油菜的光合速率和蒸騰速率

種子包衣處理的油菜較裸露種子發育的植株色素含量有所提升，但固定化與否似乎對色素的影響不大(見表3)。

表3 油菜色素質量濃度

2.2 實驗土壤pH差異

由圖2可見，收取植物后對照組實驗土壤的pH最高，這是因為污染土壤采自遼河油田石油，本身pH較高，為8.92。其余處理的pH相對對照組均有降低，其中T2無植物實驗土壤的pH高于其他有植物實驗土壤，而T1、T3、T4和T5實驗土壤pH較CK分別顯著降低了1.86%、1.61%、2.60%、1.73%，這是因為油菜的根系會分泌有機酸和腐殖質類物質，可以降低土壤pH。此外，添加降解菌和有機肥也可能改善土壤鹽堿環境，使得土壤pH較自然降解情況下降低。

圖2 實驗土壤pH

2.3 對PAHs的去除效果

由表4可見，實驗組的總PAHs都低于對照組，特別是T3、T4、T5聯合修復的3個處理與對照組相比差異顯著，T3殘留的總PAHs質量濃度最低，為(3.88±0.61) mg/kg，比CK降低了55.25%。其中，各組低環PAHs質量濃度為1.99～4.61 mg/kg，高環PAHs為1.70～4.06 mg/kg。T1、T2和T5表現為高環PAHs含量大于低環PAHs，其余處理均表現為低環PAHs含量大于高環PAHs。在T1中，由于油菜對PAHs的吸收作用，與CK相比低環PAHs降低了53.14%，高環PAHs降低了22.66%。T2只接種了降解菌，該降解菌表現出對低環和高環PAHs相似的去除效果，其中低環PAHs比CK降低了19.09%，而高環PAHs降低了17.98%。T3既種植油菜也接種降解菌，低環和高環PAHs含量較對照都大幅降低，其中低環降低了52.71%，高環降低了58.13%。由此可以看出，油菜的種植對低環PAHs去除作用較明顯，接種降解菌可以更好地去除高環PAHs，植物與微生物之間起到相互促進、互為補充的作用。T4經油菜種子載體固定化降解菌處理后，PAHs的含量相比T3反而又有所增加，不過T3～T5殘留的總PAHs濃度差異不大。

表4 實驗土壤中殘留的PAHs質量濃度1)

3 討 論

本研究比較了植物與微生物單一或聯合去除污染土壤中PAHs的效果。首先，土壤中的PAHs在自然條件下也會通過風化、揮發、光降解和微生物降解等作用而去除[12]。植物修復和微生物修復都能提升PAHs的去除率。油菜單獨處理主要對2～3環的低環PAHs效果較好，這是因為植物對小分子物質的吸收效果更好。有研究表明，植物根系吸收并傳輸到地上部分的PAHs多為低環PAHs，高環PAHs因水溶性低，不易被植物吸收，更很難通過木質部向上運輸[13]。已有研究表明，除植物吸收PAHs外，聯合微生物修復往往能促進植物生長和提高PAHs的去除[14]。游離降解菌對植物生長表現出促進作用，在植物葉長、葉寬、根長和莖長上都有體現[15]。但將降解菌固定化處理后，油菜的生理生長表現變差，可能的原因是降解菌突破包衣與外界土壤接觸可能會延緩，因此在同樣的修復周期內植物生長就延遲，導致收獲的生物量減少；另一可能的原因是，降解菌包埋在種子載體的包衣內，凝膠無法及時轉運代謝產物，導致大量幼苗根系分泌物和降解菌代謝廢物積累，使得植物生長受到抑制[16-17]。

將油菜與降解菌聯合起來后，土壤中PAHs(無論是低環還是高環)含量都出現大幅下降，可見植物聯合微生修復可以結合植物吸收與微生物降解的優點，既發揮了植物根系對污染物的吸收作用，又利用了根際微生物與植物根系的共生作用，可提高降解菌的降解效果，因此去除效果好[18]。油菜聯合降解菌修復的T3、T4和T5處理對PAHs去除效果均優于單一修復，其中油菜包衣種子種植并接種復合菌劑的處理效果最佳，將降解菌固定化后，去除效果反而下降，這同樣可能是因為凝膠包衣對降解菌利用有機污染物形成了障礙。

4 結 論

(1) 油菜包衣種子較未包衣種子的植株生物量增加，葉寬和莖長增長，色素含量增多，光合速率加快。

(2) 油菜聯合降解菌可以互相促進、互為補充，從而顯著提高生物量和光合速率等，對PAHs的降解效果增強，并可改善土壤pH，但將降解菌固定化的效果不如讓降解菌游離化。

(3) 油菜對低環PAHs去除效果較好，主要是吸收作用；而降解菌可以更好地通過降解作用去除高環PAHs。