預混合飼料中維生素A、D3 和E快速聯檢的高效液相色譜法

段春宇

（山東省莒南縣檢驗檢測中心 山東臨沂 276600）

脂溶性維生素是畜禽維持健康、生長、繁殖和生產所必需的一類有機微量營養物質。脂溶性維生素對于畜禽體內的代謝活動具有調節作用，促進生長，增強動物抗病和抗應激能力，一般情況下，畜禽不能合成或難以合成足量的維生素滿足自身的需要，必須由日糧提供，但是飼料中的含量也是有限的，不夠滿足養殖業對于所飼喂畜禽快速、健康生長的需求，在飼料中添加適量維生素是保障畜禽健康的重要途徑。

脂溶性維生素對畜禽生長具有重要作用，但是需要量是微量的，過多攝入會導致畜禽中毒，農業部1224 公告制定了推薦用量和最高限量，因此飼料生產企業與養殖企業要根據飼養的不同畜禽品種與畜禽生長階段對維生素的營養需要量進行調控，這就需要準確檢測飼料中脂溶性維生素的含量，尤其是預混合飼料中脂溶性維生素的含量，準確檢測，精準調控，既滿足畜禽營養，又符合國家規范要求。

國家標準對于VA、VD、VE 的檢測是分開三個標準方法，對于檢測任務繁重的飼料廠來說，工作量較大，檢測成本較高。本研究旨在探索一種方法，同時檢測以上三種脂溶性維生素的含量，為飼料企業快速、高效檢測提供良好方法。

2 材料和方法

2.1 試劑和材料

甲醇（色譜級）（默克公司）、維生素A 乙酸酯標準品（德國Dr.Ehrenstorfer 公司）、VD標準品（德國Dr.Ehrenstorfer 公司）、VE乙酸酯標準品（Fluka 公司）、0.45μm 有機系微孔過濾器、100mL棕色容量瓶等。

2.2 主要儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀配紫外檢測器、高速混勻器、恒溫水浴鍋、超聲波清洗儀、超純水儀、分析天平等。

2.3 樣品前處理

稱取試樣1g，精確至0.0001g，置于100mL 棕色容量瓶中，加60mL 甲醇渦旋，轉移至水浴鍋，60℃15min，蓋子不要太緊，冷卻，超聲30min，冷卻定容，過0.45μm 有機系微孔過濾器到進樣瓶中，待檢。

2.4 標準溶液配制

準確稱取標準品VA 乙酸酯0.1000g，VD0.0100g，VE 乙酸酯0.2000g 分別于100mL 棕色容量瓶中，加入30mL 甲醇渦旋，再加30mL 甲醇，搖勻，放入60℃水浴15min，冷卻后超聲30min，待再次冷卻后用甲醇定容，搖勻，即得2,907.00IU/mL VA、4,000.00IU/mL VD、2.00IU/mL VE 標準儲備液，置于-18℃冰箱避光保存，有效期6 個月。用甲醇逐級稀釋成VA 乙酸酯11.63、58.14、116.28、290.70、581.40IU/mL；VD16.00、80.00、160.00、400.00、800.00IU/mL；VE 乙酸 酯0.008、0.040、0.080、0.200、0.400IU/mL的系列混合標準溶液。

2.5 色譜條件

色譜柱：Kromasil C色譜柱（規格：150×4.6mm，粒度5μm）；流動相：甲醇；流速：1.0mL/min；紫外檢測器波長：285nm；柱溫40℃；進樣量：20μL。

3 結果與分析

3.1 測定圖譜

檢測圖譜峰形好，保留時間穩定，標準樣品色譜測定圖譜見圖1、加標樣品見圖2、待檢樣品見圖3。

圖1 標準樣品圖譜

圖2 加標樣品圖譜

圖3 待檢樣品圖譜

3.2 線性關系、檢出限和定量限

配制好的標準系列溶液，按2.5 色譜條件進行檢測，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線。結果表明，VA 線性關系良好，線性方程為y=15.42414x+38.18668，相關系數（r）為0.99989；VD線性關系良好，線性方程為y=0.693718x+1.04216，相關系數（r）為0.99997；VE 線性關系良好，線性方程為y=4.64979x+4.82632，相關系數（r）為0.99998。以基線噪聲3 倍的峰面積相應的樣品檢出濃度作為檢出限，以10 倍的峰面積相應的樣品檢出濃度作為定量限，測得3 種維生素的檢出限和定量限，即VA 檢出限為1.0×10IU/kg、定量限為3.3× 10IU/kg；VD檢出限為1.5× 10IU/kg、定量限為5× 10IU/kg；VE 檢出限為6IU/kg、定量限為20IU/kg。

3.3 精密度和回收率

取兩份不同的空白預混合飼料樣品，稱取1g，精確至0.0001g，分別添加適量的VA、VD和VE 的標準儲備液溶液，制得三個添加水平的樣品，簡稱加標1 和加標2，按照2.3 方法處理加標樣品，每個添加重復5 次，然后分別上機測定。隨機選取維生素預混合飼料6 份：樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6，進行平行性測定，分別做5 次平行。檢測結果見表1，其相對標準偏差均小于10%，說明檢測方法的精密度較好。測定結果顯示，加標1回收率VA 為94.69%～97.40%、VD為95.67%～98.91%、VE 為95.32%～97.28%，加標2 回收率VA 為96.77%～98.38%、VD為94.93%～98.04%、VE 為94.39%～96.45%%，說明方法準確性較好。

表1 待檢樣品測定結果

表2 回收率試驗結果

4 結論

本文探索了一種能同時、快速檢測預混合飼料中VA、VD和VE 含量的檢測方法。與GB/T 17817—2010、GB/T 17818—2010、GB/T 17812—2008 相比，可以一次前處理、一次上機同時檢測三種脂溶性維生素的含量，節省了時間和試劑成本。該方法前處理操作簡單，流動相成分僅一種，步驟少、方便快捷；檢測結果精密度高、準確度好。該方法準確、簡便、高效，為實驗室繁重檢驗任務提供良好的參考。