木犀草素對抗2 型糖尿病大鼠心肌纖維化的機制研究

黃 婷，唐建東，李真真，白 楊，劉惠雙，徐在革

（1.鄭州市第七人民醫院內分泌科，鄭州 450006；2.鄭州市第七人民醫院營養科，鄭州 450006）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是全球范圍內常見的流行病，發病率和病死率逐年增高，2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2D）約占DM 患者死亡的90%以上[1-2]。糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是DM 的主要并發癥，其特征是左室舒張和/或收縮功能障礙，目前普遍認為心肌肥大和心肌纖維化是其主要的病理特征[3-4]。

近年來，隨著中醫藥的快速發展，天然產物對疾病的預防效用成為研究熱點[5]。木犀草素（luteolin，LUT）是一種天然的常見黃酮類化合物，可在多種植物和草藥中提取，LUT 可作為一種抗氧化劑和抗炎劑，在多種疾病治療等方面均有報道[6-7]。研究[8]證實，LUT 可明顯抑制T2D 大鼠對胰島素的抵抗作用及炎癥反應。研究[9]發現，LUT 可明顯改善阿霉素引起的H9C2 心肌細胞損傷。但還未見LUT 與T2D 心肌纖維化關系的相關報道。以往研究發現，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）-沉默信息調節因子3（sirtuin3，SIRT3）信號通路參與調控肝纖維化發展[10]，研究[11]發現，運動可能通過激活AMPK-SIRT3 信號通路改善T2D 大鼠骨骼肌胰島素抵抗。關于AMPK-SIRT3 通路在T2D 心肌纖維化中的作用還未可知。筆者推測，LUT 可能通過激活AMPKSIRT3 信號對抗T2D 大鼠心肌纖維化，因此，本研究將通過體內和體外實驗共同驗證此猜想，并進一步探討LUT 潛在的抗T2D 心肌纖維化機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SPF 級Sprague-Dawley（SD）大鼠24 只，體質量180～220 g，購自北京科興中維生物技術有限公司，許可證號：SYXK（京）2020-0054。飼養期間自由進食飼料，自由飲水，12 h 晝夜循環，溫度23～26℃。鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ，純度HPLC ≥98%）購自美國Sigma；LUT（純度HPLC≥98%）、AMPK通路抑制劑Compound C（純度HPLC ≥98%）購自上海aladdin；Masson 三色染色試劑盒購自北京Solarbio；RIPA 裂解液、CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒購自北京YITA；一抗fibronectin、collagen I、α-SMA、p-AMPK、AMPK 和SIRT3 及 二抗HRP 標記的山羊抗兔均購自英國Abcam；H9C2細胞購自美國ATCC；DEME 培養基購自上海LMAI Bio；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自北京BIOSIC；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（顯色法）購自上海Beyotime。BPH-9042 細胞培養箱購自上海一恒；Multiskan FC 酶標儀購自美國Thermo；CX43 生物顯微鏡、FV3000 激光掃描共聚焦顯微鏡購自日本Olympus；Gallios 流式細胞儀購自美國BECKMAN。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及藥物處理 SD 大鼠適應性喂養7 d后，分為正常（Control）組，T2D 組，T2D+LUT 組，每組8 只。T2D 組和T2D+LUT 組SD 大鼠禁食12 h后通過腹腔注射1% 35 mg/kg STZ 誘導T2D 模型，注射后繼續喂食高脂高糖飼料，持續7 d 后，于大鼠尾部靜脈取血檢測血糖，當超過3 次隨機檢測血糖濃度≥16.7 mmol/L 則表明T2D 模型制備成功[12]。Control 組腹腔注射相同體積的檸檬酸鈉緩沖液，并一直使用普通飼料喂養。T2D+LUT 組大鼠于造模成功后第1 天開始灌胃給予40 mg/kg LUT[8]，Control 組和T2D 組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水，每天1 次，持續4 周。實驗結束后大鼠腹腔注射3% 50 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉，收集各組大鼠左心室心肌組織樣本，部分組織用4%多聚甲醛固定后制作4 mm 的石蠟切片；其余組織凍存于-80℃，用于Western blot 檢測。

1.2.2 Masson 染色觀察心肌組織病理學并測定心肌膠原容積分數 取1.2.1 中獲取的各組組織切片按照常規操作脫蠟，參照Masson 三色染色試劑盒說明書進行Masson 染色，大鼠心肌細胞染色呈紅色，間質膠原纖維呈藍色，使用光學顯微鏡觀察拍攝大鼠心肌結構及纖維化程度。通過Image Pro Plus 測定各組心肌膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF），CVF（%）=膠原面積/視野總面積×100%。

1.2.3 Western blot 檢測心肌組織中纖維化標志蛋白及AMPK-SIRT3 通路相關蛋白水平 取出凍存的各組心肌組織，每100 mg 組織加入1 mL 預冷的RIPA 裂解液通過超聲破碎后離心提取上清液，使用BCA 試劑盒檢測各組蛋白濃度。按照1: 5 比例混合蛋白和上樣緩沖液后，在95℃煮沸15 min 使蛋白變性。按照40 mg總蛋白上樣，經SDS-PAGE 分離蛋白后經半干法將蛋白轉移至PVDF 膜上。使用5%牛血清白蛋白封閉1 h，洗去封閉液后添加一抗fibronectin、collagen I、α-SMA、p-AMPK、AMPK 和SIRT3（稀釋比例1: 1 000）4 ℃過夜孵育，隔天使用TBST 洗膜后，添加HRP 標記的山羊抗兔二抗（稀釋比例1: 5 000）在37 ℃孵育1 h，使用TBST 沖洗后，添加ECL 顯影，在凝膠成像系統中曝光，保存圖片。使用Image J 軟件分析各蛋白條帶的灰度值，β-actin 作為內參蛋白。目的蛋白的相對表達量=實驗組目的蛋白的灰度值/對照組蛋白的灰度值。

1.2.4 心肌細胞H9C2 培養 H9C2 細胞維持在DEME培養基中（含1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清），在37℃培養箱中培養，至細胞融合度達到0%～90%，即可進行傳代培養。

1.2.5 LUT 濃度及干預時間選擇 取對數期且生長狀態良好的H9C2 細胞接種于6 孔板中（1×104個/孔），依次分為對照組（Control），高糖組（HG），高糖和不同濃度LUT 組[HG+LUT（5、10、15 mM）]。Control 組為常規培養條件添加5.5 mmol/L 葡萄糖，HG 組為常規培養條件下添加30 mmol/L 葡萄糖[13]，HG+LUT（5、10、15 mM）組為常規培養條件下添加30 mmol/L 葡萄糖和不同濃度（5、10、15 mM）的LUT，分別干預處理24、48、72 h 后收集細胞，通過CCK-8 法檢測各組細胞的增殖情況。

1.2.6 細胞分組 取對數期且生長狀態良好的H9C2細胞接種于6 孔板中，依次分為Control 組、HG組、HG+LUT 組、AMPK通路抑制劑（Com.C）組（10 mM）[14]、高糖+LUT+AMPK通路抑制劑（HG+LUT+Com.C）組。Control 組，HG 組參照1.2.5中方法處理，HG+LUT 組為常規培養條件下添加30 mmol/L 葡萄糖和5 mM LUT，Com.C 組為常規培養條件下添加10 mM Compound C，HG+LUT+Com.C 組為常規培養條件下添加30 mmol/L 葡萄糖、5 mM LUT和10 mM Comound C，以上各組細胞均培養48 h。

1.2.7 流式細胞術檢測各組H9C2 細胞凋亡率 將按照1.2.6培養的各組H9C2細胞接種于96孔板中（1×106個/孔），添加200 mL 結合緩沖液重懸細胞，分別添加5 mL Annexin V-FITC 和碘化丙啶（PI），混勻后室溫避光孵育20 min，通過流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.8 TUNEL 法檢測各組H9C2 細胞凋亡水平 收集按照1.2.6 培養的各組H9C2 細胞，使用4%多聚甲醛固定15 min，按照TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒說明操作，最后添加DAB 反應10 min。在熒光顯微鏡下觀察拍照，記錄每個視野下凋亡的細胞數量。TUNEL 陽性細胞率=單個視野下的凋亡細胞數量/單個視野下的總細胞數量×100%。

1.2.9 Western blot 檢測各組H9C2 細胞中纖維化標志蛋白及AMPK-SIRT3 通路相關蛋白水平 收集按照1.2.6 培養的各組細胞，通過RIPA 法提取總蛋白，參照1.2.3 方法分析各蛋白水平。

1.3 統計學方法 采用Graphpad Prism 9.0 對數據進行分析，多組間比較采用One-way ANOVA分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05 代表數據差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LUT 對STZ 誘導的糖尿病大鼠心肌纖維化和AMPK-SIRT3 通路的影響 與Control 組相比，T2D組大鼠心肌組織中細胞排列紊亂，間質膠原纖維分布增加，CVF 顯著增大；與T2D 組相比，T2D+LUT 組大鼠心肌組織中細胞排列紊亂及間質膠原纖維分布增加得到改善，CVF 顯著降低，見圖1；心肌組織中fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平顯著增高，p-AMPK/AMPK 比值和SIRT3 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。心肌組織中fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平顯著降低，p-AMPK/AMPK 比值和SIRT3蛋白水平顯著增高（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組相關蛋白水平比較（，n =3）

表1 各組相關蛋白水平比較（，n =3）

注：與Control 組比較，# P ＜0.05；與T2D 組比較，△P ＜0.05

圖1 Masson 染色觀察心肌組織病理學

2.2 LUT 對HG 誘導的H9C2 細胞增殖活力的影響 HG 組H9C2 細胞增殖活力較Control 組明顯降低（P＜0.05）；在HG 處理的同時添加不同劑量的LUT 處理48 h 和72 h 后H9C2 細胞增殖活力較HG組得到明顯的改善（P＜0.05），在處理24 h 時HG+LUT（5 mM）組H9C2 細胞增殖活力則與HG組無明顯差異（P＞0.05）。因此，為避免較高濃度的LUT 對細胞生長產生不利影響，故而選擇5 mM 的LUT 處理48 h。結果見表2。

表2 LUT 促進HG 誘導的H9C2 細胞增殖（，n =3）

表2 LUT 促進HG 誘導的H9C2 細胞增殖（，n =3）

注：與Control 組比較，# P ＜0.05；與HG 組比較，△P ＜0.05；與HG+LUT（5 μM）組比較，▲P ＜0.05；與HG+LUT（10 μM）組比較，□P ＜0.05

2.3 LUT 對HG 誘導的H9C2 細胞凋亡、纖維化及AMPK-SIRT3 通路的影響 與Control 組相比，HG 組H9C2 細胞凋亡率和TUNEL 陽性細胞率明顯升高（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+LUT 組H9C2 細胞凋亡率和TUNEL 陽性細胞率明顯降低（P＜0.05）。見圖2，圖3。進一步研究發現，與Control 組相比，HG 組H9C2 細胞中fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平明顯增高（P＜0.05）；此外，p-AMPK/AMPK比值和SIRT3 蛋白水平明顯降低（P＜0.05）；與HG組相比，HG+LUT 組H9C2 細胞中fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平明顯降低（P＜0.05）；此外，p-AMPK/AMPK 比值和SIRT3 蛋白水平明顯升高（P＜0.05），結果見表3。

圖2 流式細胞術檢測各組H9C2 細胞凋亡率

圖3 TUNEL 法檢測各組H9C2 細胞凋亡水平

表3 各組H9C2 細胞凋亡水平及蛋白表達比較（，n =3）

表3 各組H9C2 細胞凋亡水平及蛋白表達比較（，n =3）

注：與Control 組比較，# P ＜0.05；與HG 組比較，△P ＜0.05；與HG+LUT 組比較，▲P ＜0.05

2.4 AMPK 通路抑制劑可以逆轉LUT 的治療作用 與HG 組相比，Com.C 組H9C2 細胞凋亡率和TUNEL 陽性細胞率明顯增高；且細胞中fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平明顯增高，p-AMPK/AMPK 比值和SIRT3 蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。與HG+LUT組相比，HG+LUT+Com.C 組H9C2 細胞凋亡率和TUNEL 陽性細胞率明顯增高；且細胞中fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平明顯增高，p-AMPK/AMPK 比值和SIRT3 蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。

3 討論

心肌細胞纖維化是DCM 的突出病理特征之一，同時，T2D 心肌纖維化是導致心力衰竭的主要原因[15]。目前對DCM 的治療主要依賴部分化學藥物，如胰島素等，通常具有較大的副作用，效果不理想，缺乏針對性的DCM 治療方法。究其原因可能是因傳統化學藥物作用靶點單一。傳統的中藥具有多靶點協同作用的優勢，因此，有必要尋找新的、更安全有效的傳統中藥以控制和治療DCM[16]。本研究通過STZ 復制T2D 大鼠模型，后給予LUT 處理，發現LUT 可明顯改善T2D 大鼠心肌組織中細胞排列紊亂及間質膠原纖維分布增加情況，且CVF 亦顯著降低，此外，LUT 可明顯逆轉T2D 大鼠心肌組織中fibronectin、collagen I 和α-SMA的高表達。fibronectin、collagen I 和α-SMA 屬于纖維化標志蛋白，增加其表達，肝腎纖維化程度也顯著增加[17-18]。本研究結果表明，LUT 可能抑制STZ誘導的大鼠心肌組織纖維化。

纖維化是一個常見且復雜的病理生理過程，AMPK 是一個參與保持機體物質與能量平衡的重要分子。以往大量研究證實，AMPK 參與多種疾病的發生發展，且在調控纖維化的過程中發揮著重要的作用[19-20]。研究[21]發現，柚皮素可通過激活AMPK 相關通路增強抗氧化反應，減輕心肌纖維化進而明顯削弱DM 小鼠的心肌損傷。在多種疾病模型中，SIRT3已被報道為AMPK 的下游效應物，AMPK-SIRT3 信號的激活有助于改善線粒體功能，緩解疾病的進展[22-23]。研究[24]表明，雷公藤紅素可通過激活AMPK-SIRT3 信號促進抗炎作用，減輕肝纖維化。本研究結果顯示，在STZ 誘導T2D 模型中，大鼠心肌組織中p-AMPK/AMPK 比值和SIRT3 蛋白水平顯著降低，但經LUT 處理后，p-AMPK/AMPK比值和SIRT3蛋白水平明顯回升，以上結果表明，在體內，LUT 可能通過激活AMPKSIRT3 信號參與調控大鼠的心肌纖維化。

為進一步驗證LUT 是否通過激活AMPK-SIRT3 信號參與調控大鼠的心肌纖維化，本研究在體外培養心肌細胞H9C2。首先，通過檢測LUT 對H9C2 細胞增殖活力的影響，篩選LUT 合適的作用濃度和處理時間，發現LUT 可促進HG 誘導的H9C2 細胞增殖；其次，通過檢測LUT 對H9C2 細胞凋亡的影響，發現LUT可顯著降低HG 誘導的H9C2 細胞高凋亡率，表明LUT 參與調控H9C2 細胞增殖及凋亡過程。為進一步探究LUT 對心肌細胞纖維化的影響，本研究通過檢測fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平發現，LUT可明顯降低HG 誘導的H9C2 細胞中高fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平，同時，LUT 還可明顯改善HG對AMPK-SIRT3信號的抑制作用。以上結果表明，在體外，LUT 可能通過激活AMPK-SIRT3 信號參與調控心肌細胞纖維化，與體內結果一致。為更深入的探究LUT 與AMPK-SIRT3 信號的關系，本研究通過添加AMPK 抑制劑干預AMPK-SIRT3 信號，發現AMPK抑制劑與LUT 作用相反，且抑制AMPK-SIRT3 信號可逆轉LUT 對心肌細胞的治療作用。

綜上所述，LUT 通過激活AMPK-SIRT3 信號對抗T2D 大鼠心肌纖維化，本研究為臨床上使用LUT 治療T2D 心肌纖維化提供了理論依據。但本研究并未在大鼠體內使用通路抑制劑完善結論的可信度，且本研究僅是探究了LUT 對AMPK-SIRT3 信號的影響，并未對其他的作用靶點進行研究，故尚存在一定的局限性，仍需后續更深入的研究。