正交試驗法提取益腎止暈丸有效成分的分析

張 瑋

（河南省中西醫結合醫院，鄭州 450004）

益腎止暈丸為河南省中醫藥研究院醫院院內協定方，由淫羊藿、巴戟天、杜仲、當歸、黃柏、知母、女貞子、墨旱蓮、白芍、炒酸棗仁等多味中藥材組成，具有補腎益陰、消眩止暈之功效，臨床主要用于陰陽兩虛所致頭暈、頭痛、體倦乏力、腰膝酸軟等癥，也可用于高血壓、圍絕經期綜合征見上述癥狀者。為方便患者臨床應用，現將劑型選定為濃縮丸劑，對淫羊藿、巴戟天、黃柏、知母、墨旱蓮、杜仲6 味藥物進行煎煮提取，其余藥味采用粉碎后入藥，提高用藥效率。淫羊藿為方中重要藥物，具有滋陰補陽之功效，其主要含有為淫羊藿甙（Icariin）、淫羊藿次甙（Icariside）、去氧甲基淫羊藿甙（des-O-Methylicariin）、β-去水淫羊藿素（β-anhy -Droicaritin）、淫羊藿糖甙（Epimedoside）等黃酮類成分，此外還含有木脂素、生物堿等多種化合物[1-3]。現代研究表明，淫羊藿中的主要化學成分淫羊藿苷具有廣泛的生物活性，具有保護心腦血管系統、促進造骨細胞的增殖和發育、調節免疫和抗腫瘤等多種重要的藥理作用，具有較高的藥用價值[4-7]。此外，淫羊藿苷具有良好的水溶性，可以作為益腎止暈丸煎煮液的標志物，故本研究采用正交試驗法，選取淫羊藿苷為觀測指標，采用高效液相色譜法（HPLC）測定，優選煎煮提取工藝，為其臨床應用提供參考依據。

1 儀器與試藥

LIBROR-160DPT 萬分之一分析天平（日本島津公司）；Waters 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；AE240 十萬分之一分析天平（瑞士METTLER 公司）；GT-350W 超聲波提取器（濟寧科技超聲電子有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵（鞏義市英峪儀器廠）；恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）；DLSB低溫冷卻循環泵（鄭州凱鵬實驗儀器有限公司）。當歸、女貞子、炒酸棗仁、白芍、淫羊藿、巴戟天、黃柏、知母、墨旱蓮、杜仲（亳州市康博中藥飲片有限公司提供）。淫羊藿苷對照品（中國食品藥品檢定研究院）。色譜用甲醇、乙腈（德國Merck 公司）；重蒸水；分析純。

2 方法與結果

2.1 正交試驗 采用正交試驗法對提取的主要影響因素和水平進行篩選，考察因素提取次數（A）、提取時間（B）、加水量（C）、空白（D），見表1。

2.2 煎煮提取正交試驗安排和儲備液的制備 按正交試驗表安排各試驗。稱取當歸、女貞子、炒酸棗仁、白芍、淫羊藿、巴戟天、黃柏、知母、墨旱蓮、杜仲，共9 份，按表1 因素水平進行實驗。將上述1～9 號提取液濃縮至1 000 mL，移至量瓶中搖勻，作儲備液。

2.3 儲備液中淫羊藿苷的含量測定 參照高效液相色譜法[8]。色譜條件 填充劑：十八硅烷鍵合硅膠；流動相:乙腈-水（30:70）；淫羊藿苷檢測波長：270 nm。柱溫：35 ℃；流速：1 mL/min。

對照品溶液：取淫羊藿苷對照品，加入甲醇，制成含淫羊藿苷32 μg/mL 溶液，搖勻。

供試品溶液：精密量取上述正交試驗貯備溶液各10 mL，置入量瓶，加乙醇稀釋至25 mL，靜置至室溫，再次加乙醇稀釋至25 mL，搖勻，超聲處理20 min，濾過。測定法：精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀。

2.4 供試品溶液中淫羊藿苷含量測定方法學[9-12]

2.4.1 陰性對照試驗 根據上述色譜條件，將淫羊藿苷對照品溶液、不含淫羊藿的陰性對照溶液、正交試驗供試品溶液分別注入液相色譜儀。在與淫羊藿苷對照品溶液色譜圖相應保留時間處，供試品溶液色譜有相應吸收峰出現，分離良好；陰性對照溶液色譜無相應吸收峰出現。見圖1、圖2 和圖3。

圖1 淫羊藿苷對照品色譜圖

圖2 供試品溶液色譜圖

圖3 不含淫羊藿陰性對照溶液色譜圖

2.4.2 線性關系 稱取淫羊藿苷對照品，加入甲醇，制成含淫羊藿苷0.032 mg/mL 的溶液為對照品溶液。分別吸取對照品溶液2、4、6、8、10、20 μL，注入液相色譜儀測定峰面積，橫坐標：淫羊藿苷進樣量（μg），縱坐標：峰面積積分值，計算回歸方程，繪制標準曲線，淫羊藿苷進樣量0.064～0.640 μg，進樣量（X）與峰面積（Y）成線性關系，回歸方程：Y=2.32×106X-2.21×104，r=0.999 5。

2.4.3 穩定性試驗 吸取3 號正交試驗儲備液，依法制備供試品溶液，分別在制備后0、1、3、6、8、12 h 測定淫羊藿苷的含量，結果平均峰面積為717 138，RSD為1.12%，提示淫羊藿苷在于12 h 內基本穩定。

2.4.4 精密度試驗 取同一供試品溶液，進樣6 次，測定峰面積，平均峰面積714 210，RSD=1.03%，結果表明儀器精密度較好。

2.4.5 重復性試驗 吸取3 號正交試驗儲備液，平行制備供試品溶液5 份，依法測定，淫羊藿苷平均含量0.078 58 mg/m，RSD=0.95%。

2.4.6 回收率試驗 量取3 號正交試驗貯備液（淫羊藿苷含量0.078 58 mg/mL）6 份，每份5 mL，再準確加入5 mL濃度為0.09 mg/mL的淫羊藿苷對照品溶液，制成加樣回收供試品溶液，測定淫羊藿苷含量，計算回收率，平均回收率99.5%，RSD=1.04%，結果見表2。

表2 回收率結果

2.4.7 正交試驗含量測定 按照上述供試品溶液的測定方法，制備1～9 號正交試驗供試品溶液，依法測定淫羊藿苷的含量，進行正交試驗結果分析，見表3。

表3 水提取正交試驗結果

2.5 正交試驗結果分析

2.5.1 直觀分析 根據各因素3 個水平的平均值，以淫羊藿苷為指標，選擇A1、B3、C3。

2.5.2 煎煮提取正交試驗方差分析 見表4。

表4 煎煮提取正交試驗方差分析

根據方差分析結果，以淫羊藿苷為指標，提取次數影響顯著，其余因素不顯著，選擇A1；B 因素影響不顯著，B2、B3 相差不大，從節能、降費、減排考慮，選擇B2；C 因素影響不顯著，但有一定的趨勢，因此選擇C3。綜上所述，選擇A1、B2、C3。即水提取正交試驗最佳提取工藝為：加水10倍量，提取3次，每次1.5 h。

2.6 煎煮提取工藝延長試驗 上述正交試驗的提取次數為正交水平最大值，因此需要進行3 次和4 次的最佳工藝比較試驗。試驗結果顯示提取4 次和3 次的結果基本一致。從節能、降耗考慮，故選擇3 次。

2.7 煎煮提取工藝驗證試驗 按上述最佳煎煮提取工藝，進行水提取工藝3 次驗證試驗。稱取處方量，加水10 倍量，加水煎煮3 次，每次1.5 h，合并上述煎煮液，濾過，各濃縮至1 000 mL，按上述方法測定淫羊藿苷的含量，并計算淫羊藿苷的提取率和轉移率，見表5。

表5 水提取工藝驗證試驗結果 mg

3 小結

淫羊藿具有補肝腎、強筋骨、祛風濕的功效，是多種中藥方劑的常用藥。近年來，隨著現代提取技術與中醫藥的結合，關于中藥有效成分的研究成為關注重點。淫羊藿苷作為淫羊藿的主要化學成分，具有廣泛的生物活性，如抗氧化應激、抗炎、抗腫瘤、抗抑郁等，是目前研究熱點中藥材之一。以往研究顯示，淫羊藿苷通過調控細胞信號轉導通路，具有靶向治療的作用，在神經系統、循環系統、生殖系統等多種疾病中具有調節神經功能、保護心血管、調節免疫功能、改善性功能等多種作用，具有廣闊的應用前景。但我們發現，中藥有效成分的提取尤其是復方制劑中單一藥材有效成分的提取一直是研究難點，探究高效的提取工藝是開發和應用中藥材的重要手段。

目前，關于淫羊藿苷的提取方法研究較多，常用的包括傳統的水提取、醇提取及新興的微波法、高壓法、超聲法、減壓回流法、超臨界二氧化碳法等。各提取方法各具優缺點，如水提取污染小、成本低，但耗時較長；醇提取可以縮短提取時間，但成本較高；超聲法提取率高，污染小，但耗能高、成本高。由此可見，單一提取方法并不完全是用于淫羊藿的開發與應用，將多種方法結合應用于淫羊藿的提取已經逐漸取代單一方法，是中藥有效成分提取的新興技術。

本研究采用正交試驗設計，該方法是研究多因素、多水平的常用試驗設計方法，采用多指標并經正交試驗綜合平衡后所得的工藝條件，根據需要兼顧到各指標的理化性質，從全面試驗中挑選具有代表性的點，是一種高效、快速、經濟的實驗設計方法，符合益腎止暈丸的作用特點。以往研究顯示，采用正交試驗法提取復方淫羊藿咀嚼片中淫羊藿苷時，提取工藝穩定、可靠，是開發利用淫羊藿有效成分的試驗基礎，進一步佐證了本次試驗方法取得的結果可靠程度較高。HPLC 法是在經典液相色譜法的基礎上發展而來的，以液體為流動相，采用高壓輸液，將不同極性的單一溶液或不同比例的混合溶液、緩沖液等裝入固定色譜柱，從而實現對試樣的分析，可根據待分析混合樣品中各組分在色譜柱中分配系數不同，達到分離目的，具有高壓、高效、高靈敏度、應用范圍廣、分析速度快、載液流速快的三高一廣一快的特點，符合本次試驗的目的，以往研究也佐證該方法用于測定復方中淫羊藿苷的含量結果準確可靠、重復性良好，可用復方制劑的質量控制。

本試驗數據顯示，提取次數對淫羊藿苷的影響并不顯著，水提取可作為正交試驗的最佳提取方式，煎煮4 次與煎煮3 次結果并無顯著差異，3 次試驗的提取量及提取率與正交試驗結果比較均一致，淫羊藿苷的轉移率為90%左右，綜合能源、經費、時間等因素，故所選煎煮提取工藝條件穩定、可行，加水10 倍量，加水煎煮 3 次，每次1.5 h，是益腎止暈丸的最佳煎煮提取工藝。經工藝驗證，本研究所制定的制備工藝適合工業化生產，工藝穩定性較好。