慢性萎縮性胃炎病證結(jié)合動物模型研究進(jìn)展

代 蕊，杜曉泉，劉 力，呼菁玉

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院消化二科，陜西 咸陽 712046）

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）作為消化系統(tǒng)常見病之一，其病理特征是胃黏膜變薄，皺襞紊亂，固有腺體數(shù)目減少或消失等[1]。CAG 病因復(fù)雜，目前較多學(xué)者認(rèn)為本病的發(fā)生與幽門螺桿菌感染，膽汁或十二指腸液反流，免疫因素，飲食、藥物及體質(zhì)因素等有關(guān)。CAG 被定義為胃癌的一種癌前狀態(tài)，腸上皮化生或上皮內(nèi)瘤變伴胃腺體萎縮被認(rèn)為是胃癌最重要的癌前病變之一[2]。胃癌作為一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率高，治療效果欠佳，嚴(yán)重威脅著人類的生命。如果CAG 可以被逆轉(zhuǎn)，那么胃癌的發(fā)病率將大大降低。中醫(yī)藥在整體觀念及辨證論治的協(xié)助下，對CAG 的治療具有不良反應(yīng)少、可隨癥加減、療效高等獨特優(yōu)勢。因此，為了預(yù)防和逆轉(zhuǎn)CAG，研究中醫(yī)藥對CAG 的發(fā)病機(jī)制和診療方案，建立安全、穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)的病證結(jié)合動物模型是很有必要的。

1 動物模型造模方法概述

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，CAG 無特異性癥狀，臨床上主要表現(xiàn)為腹脹腹痛，反酸噯氣，不欲飲食等，根據(jù)其臨床表現(xiàn)多將其歸屬于“胃痞”“吐酸”“納呆”等范疇。通過閱讀文獻(xiàn)可知，目前常見的中醫(yī)證候動物模型主要為脾虛型、肝郁型、濕熱型、腎虛型及氣虛血瘀型。此類模型的確立是將現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所確定的疾病復(fù)制到動物身上，同時采用中醫(yī)理論將中醫(yī)證候復(fù)制到動物模型上，使動物不僅具備西醫(yī)疾病特征，還具備中醫(yī)證候特征，將“中醫(yī)”和“西醫(yī)”結(jié)合，將“宏觀”和“微觀”結(jié)合，從而建立病證結(jié)合的CAG 動物模型。

2 CAG 中醫(yī)證候模型復(fù)制

2.1 脾虛型 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“脾”在臟腑中居于核心地位，疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后，關(guān)鍵在于脾胃功能正常與否[3]。李東垣在《脾胃論》中說道：“百病皆由脾胃衰而生也”。目前研究人員制備脾虛型動物模型多在CAG 造模方式的基礎(chǔ)上加用苦寒之物、勞累、飲食失宜等方法來達(dá)到病證結(jié)合的目的。

熊武忠[4]先以0.2%的去氧膽酸鈉溶液供大鼠飲用，45 d 后運用性味偏苦寒的藥物（大黃: 枳實: 厚樸＝2:3:3）水煎成湯劑給大鼠灌胃，苦寒藥物易傷元氣，導(dǎo)致脾胃功能失調(diào)。并在飲用去氧膽酸鈉溶液2周后于大鼠足部皮下注射等量胃組織懸液及完全弗氏佐劑制成的混合乳劑0.1 mL，以此來刺激局部免疫反應(yīng)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生。7 d 后于腹腔注射胃組織懸液0.1 mL，一段時間后大鼠出現(xiàn)精神疲憊，喜蜷縮，食欲下降，毛發(fā)無光澤，便稀等癥狀，表明脾氣虛型造模成功；王佳慧[5]采用過食生冷之品及飲食不規(guī)律的方式復(fù)制脾胃虛寒型CAG 模型，方法如下：以60%冰酒精灌胃，以2 mmol/L 冰脫氧膽酸鈉溶液及30%冰酒精交替飲用，由于過食寒涼生冷之品，易導(dǎo)致脾胃陽氣虧虛，陰寒內(nèi)生，進(jìn)一步加速脾胃損傷。在飲食方面讓大鼠足量進(jìn)食1 d 后禁食1 d，以此達(dá)到飲食不規(guī)律的效果。12 周后大鼠表現(xiàn)為毛發(fā)枯槁，精神不振，活動遲緩，大便稀，體溫下降等，符合脾胃虛寒型CAG 表現(xiàn)。

2.2 肝郁型 國內(nèi)一項病例對照研究表明，精神心理刺激對CAG 發(fā)病有重要影響，而個性溫和則有利于降低其發(fā)病[6]。正所謂“土得木則達(dá)”“木賴土以培之”，肝與脾二者關(guān)系密切，相互依賴。肝氣調(diào)和則全身氣機(jī)通而不滯，肝氣郁結(jié)則氣機(jī)不暢，木壅土郁損傷脾胃而致不思飲食、腹脹等。現(xiàn)如今，較多學(xué)者采用情志刺激聯(lián)合藥物刺激的方法復(fù)制肝郁型CAG 模型。

閱讀文獻(xiàn)可知，湖南醫(yī)學(xué)院于1979 年已成功運用艾葉注射液制備出肝郁型動物模型[7]。現(xiàn)代藥理研究表明，艾葉中的部分化學(xué)成分如兒茶酚胺具有擬腎上腺素的作用，腎上腺素是一種激素和神經(jīng)傳送體，其作用于動物可使動物快速產(chǎn)生興奮效應(yīng)。徐珊等[8]采用先病后證的方法來復(fù)制肝郁型CAG 動物模型，具體方法為：以MNNG 溶液（N-甲基-N '-硝基-N-亞硝基胍）及乙醇復(fù)制CAG 模型，并于造模第7 周開始每日以鉗子夾閉大鼠尾巴30 min，佐以每周1 次皮下注射腎上腺素。造模結(jié)束后，隨機(jī)取大鼠胃黏膜組織行病理學(xué)檢查，結(jié)果呈現(xiàn)萎縮改變，且大鼠出現(xiàn)易激動，精神亢奮，甚者相互撕咬等肝郁證表現(xiàn)。

2.3 濕熱型 “飲食自倍，脾胃乃傷”“太陽內(nèi)傷，濕邪停聚，客邪再致，內(nèi)外相引，故病濕熱”。飲食因素及環(huán)境變化是致使?jié)駸嶙C發(fā)生的重要條件。

王明星等[9]運用水楊酸鈉灌胃+高脂高糖高熱量飲食+濕熱環(huán)境的方法進(jìn)行造模，20 d 后大鼠呈現(xiàn)食欲降低，大便溏，飲水量減少等表現(xiàn)，符合濕熱型動物模型。徐珊等[8]采用乙醇加MNNG 溶液的方法復(fù)制CAG 大鼠模型，并在此基礎(chǔ)上改變飲食及生活環(huán)境成功復(fù)制出病證結(jié)合的濕熱型CAG 模型，詳細(xì)過程如下：以富含豬油、糖、膽固醇等元素的高脂高糖飲食替代普通飲食，中醫(yī)認(rèn)為過食膏粱厚味易致脾胃壅滯，濕阻中焦，聚濕生熱，故而濕熱蘊結(jié)。并將大鼠置于調(diào)節(jié)箱內(nèi)，每日1次，每次2 h，使溫度維持在（33±2）℃，濕度維持在（95±3）℃，以模擬相對濕熱的氣候。10周后大鼠出現(xiàn)精神疲乏，喜扎推，毛發(fā)變黃，食欲不振，小便黃等癥狀，表明濕熱型CAG 模型制備成功。

2.4 腎虛型 腎陰腎陽作為五臟陰陽之本，與脾關(guān)系密切。腎陽虛則火不暖土，致脾陽虧虛；腎陰不足則胃陰虧虛，無以濡養(yǎng)黏膜而致黏膜萎縮。

鄒世潔等[10]采用先病后證的方法成功復(fù)制腎虛型CAG 模型，方法為：在制備CAG 模型6 周起，將濃度為0.08%的MTU（甲基硫氧嘧啶）加入脫氧膽酸鈉溶液或阿司匹林溶液中供大鼠飲用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各臟器病理組織均有一定的萎縮改變。甲基硫氧嘧啶可抑制甲狀腺激素的分泌[11]，甲狀腺激素可促進(jìn)人體正常生長發(fā)育，其分泌量減少可使胃腸排空速度減慢，蠕動減弱，進(jìn)而致使食物于胃內(nèi)儲留時間延長，胃酸分泌增加，損傷胃黏膜，進(jìn)一步加速炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

2.5 氣虛血瘀型 《醫(yī)林改錯》中曰：“元氣既虛，必不能達(dá)于血管，血管無氣，必停留而瘀”。脾胃為化生氣血之源，脾胃虛弱，運化無力，氣血化生不足，氣虛鼓動無力，血液運行不暢，故血瘀。

有學(xué)者[12-13]建立氣虛血瘀型CAG 動物模型，具體方法如下：使大鼠任意飲用每日更換1 次的0.1 g/L MNNG 溶液，同時對大鼠采取0.03 g/L 的鹽酸雷尼替丁膠囊灌胃處理，使大鼠進(jìn)食2 d 后禁食1 d，造模結(jié)束后取胃黏膜行病理檢查，結(jié)果提示：大鼠胃黏膜形成腸化。魏玥[14]以MNNG 溶液灌胃+氨水自由飲用+雷尼替丁飼料喂食3 種方法成功復(fù)制CAG 大鼠模型。其中MNNG 溶液濃度為120 u/mL，氨水溶液濃度為0.1%，雷尼替丁飼料濃度為0.03%，造模結(jié)束后隨機(jī)取大鼠胃黏膜行病理檢查，結(jié)果提示萎縮伴腸化形成。

3 CAG 模型復(fù)制方法

3.1 Hp 感染造模法 Hp（幽門螺桿菌）感染是導(dǎo)致慢性萎縮性胃炎、消化性潰瘍乃至胃癌等疾病發(fā)生的重要誘因[15]。利用幽門螺桿菌感染可達(dá)到復(fù)制CAG模型的效果。

王紅梅等[16]通過對小鼠進(jìn)行濃度為50%的乙醇灌胃，1 h后以0.5×109個/mL的Hp菌株再次灌胃處理，且做到隔日1 次的方式，一段時間后成功復(fù)制Hp 感染型CAG 小鼠模型。連大衛(wèi)等[17]復(fù)制Hp 陽性CAG模型方法為：1）將Hp 菌株加入10% FBS 的BHI 培養(yǎng)液中調(diào)節(jié)濃度為10%，并于搖床上培養(yǎng)16～18 h 以促進(jìn)Hp 菌株的生長；2）每只小鼠禁食0.5 d 后，取0.25 mL Hp 菌液進(jìn)行灌胃處理，共灌胃3 次，且每次操作之間相隔1 d；3）予2%的鹽水以增強(qiáng)Hp 感染力；4）灌胃結(jié)束7 d后為確保Hp在小鼠體內(nèi)定植成功，隨機(jī)抽取8 只小鼠進(jìn)行感染監(jiān)測。結(jié)果示：Hp 在體感染成功。然Hp 定植率較低，Hp 菌株菌力強(qiáng)弱及動物的易感性都是影響其定植成功的關(guān)鍵[18]。

3.2 多化學(xué)因素聯(lián)合造模法 N-甲基-N '-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）溶液作為一種致癌物，其可模擬硝酸鹽在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為亞硝酸胺等物質(zhì)的過程，可使DNA鏈上的堿基烷化發(fā)生突變，從而致癌；雷尼替丁作為抑酸劑，可抑制胃酸的分泌，造成胃內(nèi)低酸環(huán)境，易導(dǎo)致腸化的發(fā)生，同時低酸環(huán)境易滋生細(xì)菌；乙醇在胃內(nèi)儲留，可與胃、十二指腸黏膜直接接觸，其可導(dǎo)致黏膜變薄，黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，組織缺血壞死，引起黏膜糜爛、水腫等；氨水、去氧膽酸鈉等堿性物質(zhì)可中和胃酸，造成胃內(nèi)中性和偏堿性環(huán)境，從而使胃內(nèi)細(xì)菌繁殖，造成胃黏膜病變，此外去氧膽酸鈉可模擬膽汁反流對胃黏膜的侵害；水楊酸鈉、吲哚美辛屬于非甾體抗炎藥，此類藥物可抑制前列腺素的合成，降低前列腺素的保護(hù)作用，其作為一種弱酸可與黏膜細(xì)胞表面磷脂雙分子層相互作用，降低胃、十二指腸黏膜的疏水性，從而暴露胃酸等黏膜管腔侵蝕因素，另外可釋放大量促炎因子，加速黏膜炎癥[19-21]。

單一化學(xué)因素可造成黏膜病變，然而人體是一個復(fù)雜的機(jī)體，病變發(fā)作往往非單一因素所致，故當(dāng)前研究人員常采取多化學(xué)因素聯(lián)合的方式進(jìn)行造模。

王國棟[22]運用MNNG 溶液+雷尼替丁飼料+酒精灌胃+飲食失調(diào)的方法復(fù)制CAG 動物模型。具體方法如下：予大鼠100 ug/mL 的MNNG 溶液供其自由飲用，使其自由食用含0.03%雷尼替丁的飼料以抑制胃酸分泌，聯(lián)合每周1 次的酒精灌胃及飲食不規(guī)律（進(jìn)食與禁食逐日進(jìn)行）。歷時20 周后，大鼠胃黏膜灰白相間，彈性消失，皺襞紊亂。王維等[23]通過聯(lián)合氨水自由飲用、水楊酸鈉溶液灌胃、去氧膽酸鈉溶液灌胃及飲食失宜（禁食1 d，喂食2 d）4 種方法成功制備CAG 模型。其中，氨水濃度為0.1%，水楊酸鈉溶液濃度為2%，去氧膽酸鈉溶液濃度為25 mmol/L。

3.3 手術(shù)造模法 手術(shù)造模法是模擬持續(xù)性膽汁反流進(jìn)入胃內(nèi)不斷對胃黏膜造成損傷的方法。

史瑞等[24]采取手術(shù)造模法制備萎縮性胃炎模型。過程為：1）將活性金屬環(huán)形節(jié)育器制成彈簧，將彈簧置于壓力為137.3 kpa，溫度為120℃的高溫蒸汽環(huán)境中30 min 滅菌；2）大鼠禁食16 h 后，以濃度為3.5%的水合氯醛麻醉大鼠；3）固定大鼠，開腹，于胃前壁切一小口，將彈簧前1/3 端固定于十二指腸中，縫合傷口；4）術(shù)后禁食24 h，用青霉素腹腔注射3 d 預(yù)防感染；5）術(shù)后2 周后，以富含15%氯化鈉的熱淀粉糊灌胃，2 mL/d/只，每周二、周五各1 次。結(jié)果顯示：大鼠血清胃泌素水平下降，胃黏膜皺襞較前平坦，肌層增厚。此方法將彈簧經(jīng)胃固定于十二指腸中，通過使幽門括約肌松弛，致使膽汁不斷反流入胃，熱淀粉糊的使用可以使灌胃液在胃中停留時間延長，加快胃黏膜損傷，促進(jìn)胃黏膜炎性反應(yīng)發(fā)生。

4 CAG 中醫(yī)證候模型評價指標(biāo)

CAG 中醫(yī)證候評價指標(biāo)主要為動物的一般情況及宏觀表征情況，如毛發(fā)色澤、精神狀況、活動狀態(tài)、體質(zhì)量變化、飲食及大便情況等。

4.1 脾虛型 大鼠主要表現(xiàn)為毛發(fā)枯槁易脫落，精神不振，四肢乏力，體質(zhì)量下降，形體偏瘦，食欲差，大便不成形等癥狀，在脾氣虛的癥狀基礎(chǔ)上若出現(xiàn)大便溏，體溫下降等即為脾胃虛寒的表現(xiàn)[5，25-26]。

4.2 肝郁型 大鼠主要表現(xiàn)為皮毛無光澤，情緒低落，喜扎堆，行為抑郁，消瘦乏力，易激惹，甚者相互撕咬，挑逗后易煩躁，食欲下降，大便味臭時溏時結(jié)等[27-28]。

4.3 濕熱型 大鼠初期表現(xiàn)為體質(zhì)量增加，糞便時軟時干，后期表現(xiàn)為毛發(fā)稀疏，粗糙發(fā)黃，精神萎靡不振，喜臥，體質(zhì)量增長緩慢，食量下降，大便時干時溏，小便色黃，肛溫增加等[8，29]。

4.4 腎虛型 大鼠主要表現(xiàn)為毛發(fā)松弛，目光驚恐，雙目無神或睜眼無力，活動時間減少，喜蜷縮，乏力，體質(zhì)量減輕，二便次數(shù)增多，牙齒發(fā)黃，全身體溫下降等[30-31]。

4.5 氣虛血瘀型 大鼠主要表現(xiàn)為毛發(fā)晦暗，萎靡不振，尾涼喜蜷縮，渾身無力，反應(yīng)遲鈍，飲水量較少，體型大而消瘦，爪甲紫暗，大便不成形、時干時溏，舌質(zhì)紫暗等[14，32-33]。

5 CAG 模型評價指標(biāo)

5.1 內(nèi)鏡下表現(xiàn) 黏膜紅白相間，以白為主，黏膜粗糙，皺襞變平或消失，鏡下黏膜血管逐步顯露；黏膜呈顆粒狀或結(jié)節(jié)狀表現(xiàn)。

5.2 病理學(xué)表現(xiàn) 病理學(xué)檢查是診斷CAG 的金標(biāo)準(zhǔn)[34]。胃黏膜病理組織變化主要是觀察黏膜慢性炎癥（見表1）、萎縮（見表2）及腸化（見表3）程度等。

表1 黏膜慢性炎癥程度

表2 黏膜萎縮程度

表3 黏膜腸化程度

6 小結(jié)

慢性萎縮性胃炎作為消化系統(tǒng)常見病，中醫(yī)認(rèn)為本病發(fā)病以脾胃衰弱為基礎(chǔ)，以氣滯、血瘀、濕滯等為基本病因。為深入研究CAG 的發(fā)病機(jī)制和治療方案，臨床已建立多種動物模型造模方法，然而制備中醫(yī)病證結(jié)合動物模型尚存在一定缺陷，如：1）動物種類選取不同，模型復(fù)制周期不一致等均可對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響；2）關(guān)于CAG 中醫(yī)證候動物模型的研究及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)量較少，對于研究人員可參考的方法較為缺乏；3）中醫(yī)學(xué)中，一種病因可導(dǎo)致多種中醫(yī)證候，對動物施與單一病因，存在得到不同中醫(yī)證候的可能性；4）外界因素對造模也有影響，比如動物的墊料、光照及飼養(yǎng)條件等；5）中醫(yī)學(xué)理論眾多，對于中醫(yī)證候無明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)，致使復(fù)制中醫(yī)證候的動物模型吻合度產(chǎn)生偏差。

對于科研人員來說，選擇有效、穩(wěn)定的動物模型制備方法極為重要。因此，為推動中醫(yī)藥治療CAG取得更長遠(yuǎn)的發(fā)展，促進(jìn)建立更為安全、穩(wěn)定、高效的動物模型，制定統(tǒng)一的中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)、建立規(guī)范的模型評價體系、加大中醫(yī)藥研究領(lǐng)域人力物力的投入、構(gòu)建優(yōu)秀的病證結(jié)合動物模型科研團(tuán)隊、加強(qiáng)國內(nèi)外學(xué)術(shù)交流等是今后努力的方向。