lncRNA LINC00958靶向調(diào)控miR-597-5p對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

魏娜 侯凈 王光輝 王舒 倪青

(貴州省人民醫(yī)院乳腺外科，貴州 貴陽 550002)

乳腺癌是一種常見的惡性婦科腫瘤，是導致女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一〔1〕。迄今為止，在分子水平上乳腺癌的發(fā)病機制仍然未知。長鏈非編碼RNA(lncRNA)包含可作為ceRNA的miRNA響應(yīng)元件，并在各種病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括乳腺癌〔2〕。研究表明，LINC00958在膠質(zhì)瘤組織和細胞中上調(diào)表達，敲低其表達可抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，阻滯細胞周期，LINC00958通過調(diào)控miR-203/周期蛋白依賴性激酶(CDK)2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生中起著致癌基因的作用〔3〕。LINC00958在口腔鱗癌、非小細胞肺癌組織和細胞中高表達，能促進口腔鱗癌細胞的增殖和遷移，抑制細胞凋亡，而下調(diào)LINC00958可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖，促進細胞凋亡〔4，5〕。miR-597-5p在人乳頭瘤病毒(HPV)16陽性子宮頸癌組織中表達下調(diào)，可能是HPV16感染后宮頸癌發(fā)生的新標志物〔6〕。miR-597在乳腺癌組織中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔7〕。但LINC00958在乳腺癌組織中的表達及其對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，且LINC00958是否通過靶向調(diào)控miR-597-5p的表達影響乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡目前尚未可知。因此，本研究對LINC00958和miR-597-5p在乳腺癌組織中的表達和在MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡中的作用進行評價，并分析LINC00958與miR-597-5p之間的靶向關(guān)系，旨在闡明LINC00958的功能機制。

1 材料與方法

1.1材料 乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自中國科學院細胞研究所(中國上海)；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine 2000試劑購自Invitrogen公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)購自Sigma-Aldrich公司；靶向LINC00958的siRNA(si-LINC00958)和陰性對照(si-NC)、pcDNA-LINC00958和陰性對照(pcDNA)、miR-597-5p模擬物和陰性對照(miR-NC)、miR-597-5p抑制劑(anti-miR-597-5p)和陰性對照(anti-miR-NC)購自RiboBio公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix購自TaKaRa公司；Transwell板購自Corning公司；放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解緩沖液、雙辛可寧酸蛋白質(zhì)分析試劑盒購自Applygen公司；TBS-Tween(TBST)購自O(shè)riGene公司；二抗購自ProteinTech公司。41對配對的乳腺癌組織與癌旁組織樣本來自貴州省人民醫(yī)院2017年10月至2018年9月接受手術(shù)切除的乳腺癌患者，所有樣品通過手術(shù)獲得，并立即將切下的標本浸入液氮中，在-80℃下保存?zhèn)溆谩１狙芯恐惺褂玫慕M織方案通過醫(yī)院倫理審查委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2細胞培養(yǎng) MDA-MB-231細胞在10% FBS的DMEM中，37℃，5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3細胞轉(zhuǎn)染與分組 轉(zhuǎn)染前，將MDA-MB-231細胞以5×105/孔接種到6孔板。根據(jù)制造商的規(guī)程，當MDA-MB-231細胞達到70%～80%融合時，使用Lipofectamine 2000試劑將RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231細胞中，分為si-NC組、si-LINC00958組、miR-NC組、miR-597-5p組、pcDNA組、pcDNA-LINC00958組、si-LINC00958+anti-miR-NC組、si-LINC00958+anti-miR-597-5p組。轉(zhuǎn)染48 h，通過qRT-PCR評估siRNA或pcDNA轉(zhuǎn)染的有效性。

1.4qRT-PCR檢測LINC00958和miR-597-5p表達 通過使用TRIzol試劑從乳腺癌組織或MDA-MB-231細胞中獲得總RNA樣品。然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的指南制備cDNA。對于定量分析，將SYBR Green PCR Master Mix在Step-One Plus實時PCR。比較2-ΔΔCt方法用于計算LINC00958和miR-597-5p相對表達水平。GAPDH或U6被視為內(nèi)部對照。特異性引物序列如下：LINC00958正向引物5′-GTCTCCCTGGTTTCTCACAGTT-3′，反向5′-TCCCTGGCTACAAATAACCACA-3′；miR-597-5p正向引物5′-ACACTCCAGCTGGGTGTGTCACTCGATGAC-3′，反向5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6正向引物5′-CTC-GCTTCGGCAGCACA-3′，反向5′-AACGCTTCACGA-ATTTGCGT-3′；GAPDH正向引物5′-CTGGGCTACACT-GAGCACC-3′，反向5′-AAGTGGTCGTTGAG-GGCAATG-3′。

1.5MTT檢測MDA-MB-231細胞增殖 將轉(zhuǎn)染的1×104個MDA-MB-231細胞接種在96孔板中。48 h時，取100 μl MTT溶液(0.5 mg/ml)加入每個孔中，再孵育4 h后，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)。在490 nm的波長下讀取酶標儀OD值。

1.6Transwell檢測MDA-MB-231細胞遷移、侵襲 對于Transwell遷移測定，將無血清DMEM(200 μl)中5×104個MDA-MB-231細胞添加到Transwell的上腔室，而下腔室(600 μl)的DMEM中添加10% FBS。在37℃培養(yǎng)24 h，用棉簽除去膜上表面的細胞，室溫下用甲醇固定，0.1%的結(jié)晶紫將下表面的MDA-MB-231細胞染色20 min。使用TE2000-S倒置光學顯微鏡從3個獨立的樣本中捕獲3個不同視野的圖像，對遷移的細胞數(shù)進行定量分析。對于Transwell侵襲測定，上腔室預(yù)先涂布40 μl基質(zhì)膠。后續(xù)操作步驟同Transwell遷移測定。

1.7流式細胞術(shù)檢測MDA-MB-231細胞凋亡 膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒用于確定轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細胞凋亡。MDA-MB-231細胞在冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌2次，重懸于包含5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶溶液的100 μl結(jié)合緩沖液中。在黑暗中孵育，15 min內(nèi)上FACScan流式細胞儀確定凋亡細胞的比例。

1.8Western印跡檢測Ki-67、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達 在RIPA裂解緩沖液中裂解MDA-MB-231細胞，使用二喹啉甲酸蛋白質(zhì)分析試劑盒對蛋白濃度進行定量，并將每個樣品中等量的蛋白(20 μg)加載到10%十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠上，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。在室溫下，用5%脫脂牛奶在TBST中封閉膜1 h，然后在4℃下與一抗(稀釋為1∶10 000)孵育過夜。第2天，將PVDF膜用TBST洗滌3次，并與適當?shù)睦备^氧化物酶耦聯(lián)的免疫球蛋白(Ig)G二抗(稀釋為1∶10 000)在室溫下放置1 h。通過增強的化學發(fā)光試劑盒觀察免疫反應(yīng)帶，Image-pro plus進行Western印跡的光密度分析。GAPDH用作負載對照。

1.9雙熒光素酶報告實驗分析LINC00958與miR-597-5p的靶向關(guān)系 使用pGL3-reporter熒光素酶載體構(gòu)建包含miR-597-5p結(jié)合位點的pGL3-LINC00958野生型(WT)或突變型(MUT)載體，分別記為WT-LINC00958或MUT-LINC00958。之后將其分別于miR-NC或miR-597-5p共同轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)測定WT-LINC00958或MUT-LINC00958的熒光素酶活性。

1.10統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LINC00958和miR-597-5p在乳腺癌組織中的表達 與癌旁組織比較，乳腺癌組織中LINC00958表達水平顯著升高，miR-597-5p表達水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 LINC00958和miR-597-5p在乳腺癌組織中的表達

2.2抑制LINC00958蛋白表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響 與si-NC組比較，si-LINC00958組MDA-MB-231細胞的LINC00958、ki-67蛋白表達水平、細胞增殖均顯著降低(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 Western印跡檢測Ki-67蛋白表達

2.3抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移、侵襲的影響 與si-NC組比較，si-LINC00958組遷移、侵襲細胞數(shù)、MMP-2、MMP-9表達水平均顯著降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.4抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的影響 與si-NC組比較，si-LINC00958組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)，Bax表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的影響

2.5LINC00958靶向調(diào)控miR-597-5p的表達 LncBase Predicted v.2預(yù)測出LINC00958與miR-597-5p含有互補的核苷酸序列，見圖4。miR-597-5p組比miR-NC組顯著降低WT-LINC00958熒光素酶活性(P<0.05)，miR-597-5p組與miR-NC組MUT-LINC00958熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)，見表4。pcDNA-LINC00958組miR-597-5p表達水平(0.42±0.04)顯著低于pcDNA組(1.00±0.05，P<0.05)，si-LINC00958組miR-597-5p表達水平(3.07±0.28)顯著高于si-NC組(1.03±0.07，P<0.05)。

圖4 LINC00958的序列中含有與miR-597-5p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.6miR-597-5p過表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-597-5p組MDA-MB-231細胞的miR-597-5p表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，細胞增殖降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，遷移、侵襲細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，凋亡率顯著增加(P<0.05)，Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)，Bax表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖5、表5、圖6。

圖5 增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達

表5 miR-597-5p過表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

圖6 miR-597-5p過表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移、侵襲和凋亡的影響(結(jié)晶紫染色，×400)及細胞凋亡流式圖

2.7干擾miR-597-5p表達逆轉(zhuǎn)了抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用 與si-LINC00958+anti-miR-NC組比較，si-LINC00958+anti-miR-597-5p組MDA-MB-231細胞的miR-597-5p表達水平顯著降低(P<0.05)，細胞增殖顯著升高(P<0.05)，遷移、侵襲細胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，凋亡率顯著減少(P<0.05)，Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達水平顯著升高(P<0.05)，Bax表達水平顯著降低(P<0.05)。見表6、圖7、圖8。

表6 干擾miR-597-5p表達逆轉(zhuǎn)了抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用

圖7 干擾miR-597-5p表達逆轉(zhuǎn)了抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移、侵襲和凋亡的作用(結(jié)晶紫染色，×400)及細胞凋亡流式圖

1～2：si-LINC00958+anti-miR-NC組，si-LINC00958+anti-miR-597-5p組圖8 增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達

3 討 論

缺乏特異性的診斷和預(yù)后生物標志物可能導致乳腺癌患者的低生存率。研究表明，lncRNA在許多生物學過程中都起重要作用，而ceRNA活性與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)〔8〕。lncRNA的頻繁失調(diào)與許多細胞過程和腫瘤的發(fā)病機制有關(guān)。從機制上講，lncRNA的異常表達通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、多個靶標和途徑而參與癌細胞的功能紊亂和許多分子過程，從而引起腫瘤的發(fā)生〔9〕。有學者提出LINC00958是與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的致癌lncRNA〔10，11〕。LINC00958在頭頸部鱗狀細胞癌組織和細胞系中表達上調(diào)，其上調(diào)與腫瘤分化，晚期腫瘤分期和患者總體生存期縮短有關(guān)。在體外，LINC00958表達誘導頭頸部鱗狀細胞癌細胞活力和集落形成〔12〕。LINC00958在子宮頸癌組織和細胞中升高，LINC00958通過負調(diào)節(jié)miR-625-5p的表達，促進子宮頸癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移〔13〕。LINC00958在鼻咽癌組織標本和細胞系中上調(diào)，LINC00958過表達與鼻咽癌患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、TNM分期和較差的總體生存率顯著相關(guān)。而LINC00958下調(diào)抑制了鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲，并在體外誘導了細胞凋亡〔14〕。由此可見，LINC00958在多種癌癥中起著癌基因的作用。本研究結(jié)果提示LINC00958在乳腺癌中同樣作為致癌lncRNA，在乳腺癌MDA-MB-231細胞惡性表型中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

miRNA異常表達參與了人類惡性腫瘤的發(fā)生，進展、轉(zhuǎn)移和耐藥性，已經(jīng)成為乳腺腫瘤中基因表達的重要調(diào)節(jié)劑〔15〕。研究〔16，17〕報道m(xù)iR-597-5p在結(jié)直腸癌、胰腺癌組織和細胞中表達下調(diào)，研究〔16〕顯示，miR-597-5p可抑制結(jié)直腸癌細胞的遷移和侵襲。miR-597-5p可以減弱胰腺癌細胞的活力、菌落形成、侵襲，并降低Ki67、Bcl-2的表達，同時增加了胰腺癌細胞的凋亡及Bax的表達〔17〕。本研究結(jié)果表明，miR-597-5p過表達使乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲能力顯著降低，細胞凋亡則顯著升高，并且Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達被抑制，Bax表達被促進，與前人研究〔17〕相吻合。

研究證實，lncRNA可以充當ceRNA，競爭性地靶向miRNA并調(diào)節(jié)miRNA的功能〔18，19〕。類似的，胰腺癌中的LINC00958可以作為ceRNA競爭性結(jié)合miR-330-5p〔20〕。LINC00958可與miR-5095結(jié)合通過核糖核苷酸還的酶亞單位(RR)M2來調(diào)節(jié)宮頸癌對放射療法的細胞敏感性〔21〕。LINC00958通過靶向miR-378a-3p上調(diào)類胰島素生長因子(IGF)1R促進膀胱癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移〔22〕。本研究結(jié)果證實LINC00958可以靶向結(jié)合miR-597-5p并調(diào)節(jié)miR-597-5p的功能。在功能上，LINC00958上調(diào)降低miR-597-5p的水平，LINC00958下調(diào)提高miR-597-5p的水平。干擾miR-597-5p表達后，抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用被逆轉(zhuǎn)?？梢奓INC00958通過miR-597-5p調(diào)節(jié)了乳腺癌的發(fā)展。

綜上，LINC00958在乳腺癌組織中表達上調(diào)，抑制LINC00958表達可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖，遷移和侵襲，同時誘導凋亡，機制與靶向miR-597-5p有關(guān)。LINC00958對miR-597-5p的調(diào)控可能是乳腺癌中新的致癌調(diào)控機制。LINC00958和miR-597-5p可能成為用于預(yù)防乳腺癌患者的腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的候選治療靶標。