橄欖苦苷對APP/PS1雙轉基因小鼠淀粉樣斑塊沉積、神經炎癥和記憶損傷的保護作用

張韡

(南陽理工學院張仲景國醫國藥學院，河南 南陽 473004)

阿爾茨海默病(AD)俗稱老年性癡呆，是四大中樞神經系統退行性疾病之一。隨著我國社會人口老齡化，AD的發病率呈不斷上升趨勢，目前，AD已成為危及老年人生命的第四大病因(僅次于心臟病、腫瘤和腦卒中)〔1，2〕。因此尋找有效防治藥物是當今AD研究領域的重要課題之一。橄欖苦苷(OP)，是一種無毒的裂環烯醚萜苷類化合物〔3〕。研究表明OP有抗炎，抗氧化及抗腫瘤和降血糖等多種作用〔4〕。已有研究發現，OP可改善D-半乳糖和氯化鋁(AlCl3)誘導的小鼠學習記憶障礙〔5〕。然而OP在AD轉基因小鼠模型中的記憶功能改善作用及機制卻未見報道。而淀粉樣前體蛋白(APP)/PS1雙轉基因小鼠是目前國內外公認的AD轉基因模型鼠之一〔6〕。因此，本研究觀察OP對APP/PS1雙轉基因小鼠記憶損傷的改善作用，并分析其機制。

1 材料和方法

1.1實驗試劑 橄欖苦苷購自上海源葉生物科技有限公司；放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液購自Solarbio公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自中國炎熙生物公司；β-actin 購自美國Abgent公司；膠質纖維酸性蛋白(GFAP)抗體購自美國Sigma公司；CD11b抗體購自英國Abcam公司；β淀粉樣蛋白(Aβ)-6E10抗體購自美國Novus公司；APP抗體、β分泌酶(BACE)1抗體和糖基化末端終產物受體(RAGE)抗體購自美國Santa Cruz公司；硫黃素-S試劑購自武漢艾美捷生物公司；小鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒、白細胞介素(IL)-1β ELISA檢測試劑盒、IL-10 ELISA檢測試劑盒和轉化生長因子(TGF)-β ELISA檢測試劑盒均購自上海豐壽生物公司。

1.2儀器 冷凍切片機(VCM-2508Ⅲ型，新鄉市維克科教儀器有限公司)；熒光顯微鏡(BX53型，日本奧利巴斯公司)；Western印跡轉印系統〔elmp-cdc/elmpQ型，歐蒙醫學診斷(中國)有限公司〕；酶標儀(SuPerMax 3000FA型，上海閃譜生物科技有限公司)。

1.3實驗動物分組及給藥 20只12月齡雄性SPF級APP/PS1雙轉基因小鼠〔(29.3±3.4)g〕和10只12月齡雄性野生型C57BL/6J小鼠〔(30.1±4.3)g〕購自南京大學模式動物所，小鼠飼養在12 h晝夜循環的SPF級動物房中，且小鼠可自由進食進水。實驗動物遵從動物福利，且通過醫院動物倫理委員會審查。小鼠在飼養環境下適應3 d后進行實驗。小鼠分為WT組、TG組和TG+OP組。WT組為10只C57BL/6J小鼠。APP/PS1雙轉基因小鼠隨機被分為TG組(10只)和TG+OP組(10只)。TG+OP組小鼠每天灌胃100 mg/kg OP，持續6 w。WT和TG組小鼠每天以相同體積生理鹽水灌胃。待上述條件飼養結束后，進行后續實驗。

1.4水迷宮實驗 在直徑120 cm的水池中進行水迷宮實驗。水溫維持在25℃，且在實驗進程中保持無人和安靜的實驗環境，使用攝像頭錄制小鼠運動視頻。實驗開始前1 d訓練小鼠站臺，隨后5 d記錄小鼠找到平臺的時間及總游泳距離。在第6天拆除平臺，記錄小鼠穿過平臺的次數。

1.5小鼠腦組織分離及切片 小鼠在行為學實驗結束后，迅速用乙醚過量麻醉小鼠，快速取出完整腦組織，在冰上快速分離出雙側海馬及皮層并儲存在-80℃下。或取出完整小鼠腦組織后，在4%多聚甲醛中固定過夜。第2天在4℃下在20%和30%蔗糖溶液中依次脫水。使用冷凍切片機連續切割獲得小鼠海馬及皮層腦組織切片，保存在-80℃下。

1.6免疫熒光實驗 將皮層或海馬腦片浸入磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌3次，0.3% Triton透膜30 min，山羊血清37℃下封閉1 h。隨后孵育一抗4℃過夜(GFAP 1∶1 500；CD11b 1∶1 000；6E10 1∶1 000)。第2天洗除一抗后滴加熒光二抗(1：500)并室溫孵育1 h。熒光顯微鏡隨機選取6個視野，通過Image J軟件分析。

1.7硫黃素-S染色 將皮層腦片浸入PBS中洗滌3次后，滴加0.5%硫黃素-S溶液孵育20 min。熒光顯微鏡隨機選取6個視野，通過Image J軟件分析。

1.8Western印跡 用RIPA裂解液裂解皮層組織，取全蛋白并用BCA法進行蛋白定量。取相同體積蛋白樣品電泳。電泳后隨即電轉移至甲醇浸泡的聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，隨后加一抗4 ℃孵育過夜(β-actin 1∶1 500；RAGE 1∶1 000；BACE1 1∶1 500；APP 1∶1 000)。TBST洗膜后，室溫孵育辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗1 h，TBST洗膜后成像顯影。膠片掃描后通過Imag J軟件分析條帶灰度值。

1.9ELISA 分別取海馬和皮層組織，經勻漿后，通過ELISA分析TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β的含量。根據試劑盒說明書配制標準品和工作液，樣品稀釋液與標準品稀釋液制作過程一致。將標準品和樣品按照每孔50 μl依次加入已包被的ELISA板中，加入一抗，室溫孵育3 h。洗板5次后，加入100 μl HRP耦聯二抗，室溫孵育30 min。隨后避光加入100 μl TMB溶液室溫反應5 min，最后加入終止液。在酶標儀中檢測450 nm波長處吸光度值并制作標準曲線。根據標準曲線計算待測樣品濃度，乘以稀釋倍數后得到原始濃度。

1.10統計學方法 采用Prism7.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1OP對APP/PS1雙轉基因小鼠記憶行為的影響 水迷宮實驗結果顯示，與WT組比較，TG組第2天以后小鼠逃避潛伏期和找到平臺前的游泳距離均明顯延長(均P<0.05)，穿越隱藏平臺次數明顯降低(P<0.05)；與TG組比較，TG+OP組第2天以后小鼠逃避潛伏期和找到平臺前的游泳距離均明顯縮短(均P<0.05)，穿越隱藏平臺次數明顯增加(P<0.05)。3組平均游泳速度無明顯差異(P>0.05)。見表1～3。表明OP可改善APP/PS1雙轉基因小鼠記憶行為受損。

表1 各組逃避潛伏期比較

2.2OP對APP/PS1雙轉基因小鼠皮層淀粉樣斑塊沉積的影響 通過免疫熒光染色實驗檢測OP對APP/PS1雙轉基因小鼠皮層Aβ斑塊沉積的影響，結果顯示，與WT組比較，TG組皮層Aβ斑塊沉積明顯增加(P<0.05)；與TG組比較，TG+OP組皮層Aβ斑塊沉積明顯降低(P<0.05)。硫磺素-S染色進一步驗證小鼠皮層Aβ斑塊沉積情況，實驗結果同樣證明了OP可顯著減少APP/PS1雙轉基因小鼠皮層Aβ斑塊沉積(P<0.05)。見圖1、表4。表明OP可明顯減少APP/PS1雙轉基因小鼠皮層中Aβ斑塊沉積。

表2 各組平均游泳速度和穿越隱藏平臺次數比較

表3 各組找到平臺前的游泳距離比較

圖1 各組皮層淀粉樣斑塊沉積情況

表4 各組皮層中Aβ斑塊和硫磺素-S斑塊比較

2.3OP對APP/PS1雙轉基因小鼠皮層Aβ代謝相關蛋白表達的影響 與WT組比較，TG組皮層RAGE、BACE1和APP表達量均明顯升高(P<0.05)；與TG組比較，TG+OP組皮層這些Aβ代謝相關蛋白均明顯降低(P<0.05)。見圖2、表5。表明OP可降低APP/PS1雙轉基因小鼠皮層Aβ的沉積。

圖2 Western印跡檢測各組皮層中RAGE、BACE1和APP蛋白

表5 各組皮層中RAGE、BACE1和APP蛋白相對表達水平比較

2.4OP對APP/PS1雙轉基因小鼠皮層及海馬小膠質細胞和星形膠質細胞活化的影響 通過GFAP免疫熒光染色實驗觀察OP對APP/PS1雙轉基因小鼠皮層和海馬中星形膠質細胞活化的影響，實驗結果顯示，與WT組比較，TG組皮層和海馬中GFAP表達均明顯增高(均P<0.05)；與TG組比較，TG+OP組皮層和海馬中GFAP表達均明顯降低(P<0.05)，表明OP抑制了APP/PS1雙轉基因小鼠皮層和海馬中星形膠質細胞活化。通過CD11b免疫熒光染色實驗觀察OP對APP/PS1雙轉基因小鼠皮層和海馬中小膠質細胞活化的影響，實驗結果顯示，與WT組比較，TG組皮層和海馬中CD11b表達均明顯增高(均P<0.05)；與TG組比較，TG+OP組皮層和海馬中CD11b表達均明顯降低(P<0.05)，表明OP抑制了APP/PS1雙轉基因小鼠皮層和海馬中膠質細胞活化。見表6、圖3、圖4。

表6 各組皮層和海馬中GFAP和CD11b負荷比較

圖3 各組皮層和海馬中星形膠質細胞和小膠質細胞活化(GFAP免疫熒光，×400)

圖4 各組皮層和海馬中星形膠質細胞和小膠質細胞活化情況(CD11b，免疫熒光，×400)

2.5OP對APP/PS1雙轉基因小鼠皮層及海馬中炎癥因子水平的影響 ELISA實驗結果顯示，與WT組比較，TG組皮層和海馬中促炎因子TNF-α和IL-1β含量均明顯升高(均P<0.05)，而抗炎癥因子IL-10和轉化生長因子TGF-β含量均明顯降低(均P<0.05)；與TG組比較，TG+OP組皮層和海馬中TNF-α和IL-1β含量均明顯降低(均P<0.05)，IL-10和TGF-β含量均明顯升高(均P<0.05)。見表7。

表7 各組皮層和海馬中炎癥因子水平比較

3 討 論

已有研究發現，OP有增加大腦抗氧化酶活性、降低脂質過氧化水平和抗炎的作用〔5〕。而這些作用在一定程度上與AD進程相關。APP/PS1雙轉基因小鼠是目前公認的AD轉基因小鼠模型〔6〕。本研究結果表明OP具有抗AD的潛力。

Aβ斑塊沉積是AD發生的重要誘因，并且Aβ斑塊沉積可誘發氧化應激、神經炎癥、神經元丟失及突觸變性等繼發性病理損害或癥狀〔7〕。Aβ是由APP水解而來，APP增高可加劇Aβ沉積〔8〕。BACE1是Aβ水解過程中的限速酶，而Aβ跨血腦屏障向腦組織的轉運由RAGE介導〔9,10〕。本研究提示OP可降低APP/PS1雙轉基因小鼠皮層中Aβ斑塊沉積。

星形膠質細胞和小膠質細胞的活化是AD發生中的重要病理表現之一，且星形膠質細胞和小膠質細胞活化可加劇AD病理進程〔11,12〕。Aβ斑塊沉積誘導的神經炎癥是AD進展的重要機制之一，Aβ斑塊沉積不僅能誘導星形膠質細胞和小膠質細胞活化導致的神經炎癥，并且炎癥反應能進一步加劇星形膠質細胞和小膠質細胞活化、增生，這些反應級聯放大加劇Aβ沉積，形成惡性循環〔13〕。流行病學顯示，長期服用非甾體抗炎藥可降低AD患病風險〔14〕。本研究結果提示OP在APP/PS1雙轉基因小鼠中有抗星形膠質細胞和小膠質細胞活化及神經炎癥的作用。

綜上，OP可改善APP/PS1雙轉基因小鼠記憶功能受損并減少皮層中Aβ斑塊沉積及神經炎癥。本研究還提示OP是AD治療中具有前景的中藥之一。