黃芩素對PM2.5致大鼠氣道炎性反應及黏液高分泌狀態的影響

李燕萍 蘇菁 劉延彬 林彥濤

(河北北方學院附屬第一醫院 1耳鼻咽喉頭頸外科，河北 張家口 075000；2呼吸內科)

氣道黏液分泌過多是慢性氣道炎性疾病如慢性阻塞性肺疾病(COPD)和哮喘的標志，其特征是黏液滯留在氣道，杯狀細胞增生及黏蛋白質量或數量異常〔1，2〕。氣道黏液分泌過多與疾病的發病率和預后密切相關。PM2.5對人體健康的危害更大，因為直徑越小，進入呼吸道的部位越深。PM2.5可深入到細支氣管和肺泡，進入人體到肺泡后，直接影響肺的通氣功能，使機體容易處在缺氧狀態〔3〕。PM2.5污染會導致慢性氣道炎癥，氧化應激和黏液過度產生，從而導致小氣道在臨床上受到嚴重機械阻塞，進而導致不可逆轉的氣道氣流減少和肺功能逐步下降〔4〕。信號轉導子和轉錄激活子(STAT)6對于誘導黏液中氣道上皮細胞黏蛋白(MUC)5AC是必要和充分的。STAT6家族蛋白是轉錄因子，在細胞生長和存活中起關鍵作用，通過磷酸化作用對細胞外刺激的反應或通過細胞內非受體酪氨酸激酶而被激活〔5〕。研究發現STAT6和核因子(NF)-κB表達降低與Derp2 DNA疫苗免疫小鼠的黏液分泌減少有關〔6〕。黃芩素是一種富含水果和蔬菜的類黃酮，因其有益健康而備受關注。這些健康影響歸因于多種機制，包括抗氧化劑和抗炎活性，信號轉導途徑的修飾及與受體和其他蛋白質的相互作用〔7〕。在肺上皮A549細胞系中，黃芩素以劑量依賴性方式抑制阻塞性肺疾病大鼠氣道TLR4、NF-κB和蛋白表達。本研究擬探討黃芩素對PM2.5致大鼠氣道炎性反應及黏液高分泌狀態的影響。

1 材料與方法

1.1主要藥物、試劑及儀器 黃芩素(原料藥，純度≥97%，杭州甫洛生物科技有限公司，批號MB7006)；地塞米松片(廣東華南藥業集團有限公司，規格0.75mg/片，批號20190617)；白細胞介素(IL)-2、IL-6、MUC5AC、MUC5B酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國R&D Systems公司，批號分別為MN58748、MN63528、MN89745、MN20154、MN00237)；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司，批號分別為FG58748、FS63598)；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒SYBR Premix Ex Taq(寶日醫生物技術北京有限公司，批號DRR041A)；裂解緩沖液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號分別為10058-F4、FFP36、S0057)；蛋白提取試劑盒(上海吉熒生物技術有限公司，批號N-63524)；STAT6單克隆抗體、NF-κB單克隆抗體、β-肌動蛋白(actin)單克隆抗體(美國Neomarkers公司，批號YJ695875、KU25987M、KS0169)；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗(北京博勝經緯科技有限公司，批號SF-1335L)；電化學發光(ECL)試劑盒(廣州吉賽生物科技有限公司，批號500-163S)；超聲霧化器(賽默飛世爾科技中國有限公司，型號ED-96)；全自動血球分析儀(日本西斯美康公司，型號XI-2000)；全波長酶標儀(美國Thermo Scientific公司，型號Multiskan GO)；光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司，型號CX21BIM-SET6)；qRT-PCR儀(美國ABI公司，型號Veriti96)；凝膠成像系統(美國BIO-RAD公司，型號ChemiDoc MP)。

1.2實驗動物及分組 SPF級SD大鼠由昆明醫科大學動物實驗中心提供，雌雄各半，10～12周齡，體重210～260 g，動物生產許可證號：SCXK(云)2019-0005，動物使用許可證號：SYXK(云)2019-0015，動物質量合格證號：N0401952。根據隨機數表法將大鼠分成對照組、模型組、地塞米松組(0.09 mg/kg)〔8〕、黃芩素低劑量組(100 mg/kg)〔9〕、黃芩素高劑量組(200 mg/kg)，每組16只。本研究經河北北方學院附屬第一醫院倫理委員會批準。

1.3PM2.5顆粒物懸液制備 在建筑工地附近，用智能采樣器中的石英纖維濾膜(規格：30 cm×20 cm)采集空氣中的PM2.5顆粒物，時間為30 d，24 h/d，采集結束后，將膜對折后侵入超純水，以超聲波低溫振蕩濾紙30 min，紗布過濾洗脫液，5 000 r/min離心5次，15 min/次，用生理鹽水配成80 μg/ml顆粒物懸液，保存于4℃冰箱備用〔10〕。

1.4動物建模及給藥 用超聲霧化器將10 ml PM2.5顆粒物懸液(80 μg/ml)霧化給予模型組，地塞米松組。黃芩素低、高劑量組大鼠吸入毒染(1次/d，1 h/次)，染毒時間為4 w，制成慢性氣道炎性反應動物模型〔10〕。模型建立成功后，地塞米松組給予0.09 mg/kg地塞米松水溶液灌胃，黃芩素低、高劑量組分別給予100、200 mg/kg黃芩素水溶液灌胃，1次/d，灌胃體積均為10 ml/kg，連續給藥28 d；對照組及模型組給予相應體積(10 ml/kg)生理鹽水。

1.5支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細胞總數、主支氣管杯狀細胞陽性百分數、細支氣管杯狀細胞陽性百分數測定 生理鹽水沖洗左肺2次，回收率為80%，并使用全自動血球分析儀測定BALF中白細胞總數；阿爾辛藍-過碘酸雪夫(AB-PAS)染色觀察支氣管杯狀細胞和柱狀上皮細胞，每張AB-PAS染色切片計數1支主支氣管和5支細支氣管陽性杯狀細胞數和柱狀上皮細胞總數，計算主支氣管杯狀細胞陽性百分數、細支氣管杯狀細胞陽性百分數。

1.6BALF液中IL-2、IL-6、MUC5AC、MUC5B水平測定 剩余的BALF樣品以15 000 r/min離心10 min，然后除去上清液，并保存在-80℃冰箱內；全波長酶標儀及IL-2、IL-6、MUC5AC、MUC5B ELISA試劑盒測定BALF液中IL-2、IL-6、MUC5AC、MUC5B水平。

1.7氣管組織病理觀察 頸椎脫臼處死大鼠，剝離氣管組織，常規脫水、脫蠟，行蘇木素-伊紅(HE)染色，制作切片，顯微鏡觀察氣管組織病理變化。

1.8各組氣管組織STAT6、NF-κB mRNA表達水平測定 使用Trizol試劑從氣管組織中分離總RNA，使用逆轉錄試劑盒從每個樣品的5 μg總RNA中合成第一鏈cDNA。以下引物用于STAT6、NF-κB序列的PCR擴增：STAT6正向：5′-CTTGCGTTCAAGATGTGCCTCAACTTGACTACG-3′；STAT6反向：5′-AAGCAGGTTTGTGCATGGTGGAGTAAGTGATGT-3′。NF-κB正向：5′-TGATGCTGATCAGATGTGCCTCATGACGTAG-3′；NF-κB反向：5′-TGACTGATGAGTGCATGGTCGTAGCTAGCCT-3′。β-actin正向：5′-TGGAGAAAATCTGGCACCAC-3′；反向：5′-GAGGCGTACAGGGATAGCAC-3′。引物由寶日醫生物技術北京有限公司合成。PCR程序如下：94℃預熱2 min、94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s，總共35個PCR循環。反應體系(20 μl)包括：cDNA模板2 μl、正向和反向引物各1 μl、SYBR Premix Ex Taq 10 μl、ddH2O 6 μl。β-actin為內參基因，使用2-ΔΔCt法計算STAT6、NF-κB mRNA相對表達水平。

1.9各組氣管組織STAT6、NF-κB蛋白表達水平測定 使用RIPA緩沖液裂解氣管組織，蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度。將總蛋白(10 μg)通過十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離4 h，然后轉移到PVDF膜上。將PVDF膜在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h，并在4℃下與1∶1 000稀釋的STAT6、NF-κB、β-actin一抗孵育過夜，然后加入辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗(1∶5 000稀釋)孵育2 h，采用ECL化學發光試劑盒和凝膠成像系統觀察蛋白條帶，并分析STAT6、NF-κB蛋白相對表達水平；β-actin作為內參蛋白。

1.10統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組BALF中白細胞總數、主支氣管杯狀細胞陽性百分數、細支氣管杯狀細胞陽性百分數比較 與對照組比較，模型組BALF中白細胞總數、主支氣管杯狀細胞陽性百分數、細支氣管杯狀細胞陽性百分數明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組。黃芩素低、高劑量組明顯降低，且黃芩素高劑量組明顯低于黃芩素低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，黃芩素低劑量組明顯升高(P<0.05)，黃芩素高劑量組無明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組白細胞總數、主支氣管杯狀細胞陽性、細支氣管杯狀細胞陽性及BALF中IL-2、IL-6、MUC5AC、MUC5B水平的比較

2.2各組BALF中IL-2、IL-6、MUC5AC、MUC5B水平比較 與對照組比較，模型組BALF中IL-2、IL-6、MUC5AC、MUC5B水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組，黃芩素低、高劑量組明顯降低(P<0.05)，且黃芩素高劑量組明顯低于黃芩素低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，黃芩素低劑量組明顯升高(P<0.05)，黃芩素高劑量組無明顯變化(P>0.05)。見表1。

2.3各組氣管組織HE染色比較 對照組氣管組織結構正常；模型組氣道狹窄，氣管充血水腫，鱗狀細胞增生，炎癥細胞浸潤明顯，纖毛排列紊亂；地塞米松組、黃芩素高劑量組氣管結構基本正常，氣道上皮細胞輕微增生，有少量炎癥細胞浸潤；黃芩素低劑量組管腔狹窄，纖毛排列紊亂。見圖1。

圖1 各組氣管組織(HE染色，×400)

2.4各組氣管組織STAT6、NF-κB mRNA及蛋白表達比較 與對照組比較，模型組氣管組織STAT6、NF-κB mRNA、蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、黃芩素低、高劑量組明顯降低，且黃芩素高劑量組明顯低于黃芩素低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，黃芩素低劑量組明顯升高(P<0.05)，黃芩素高劑量組無明顯變化(P>0.05)。見表2，圖2。

表2 各組氣管組織STAT6、NF-κB mRNA、蛋白表達比較

1～5：對照組、模型組、地塞米松組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組圖2 Western印跡檢測各組氣管組織STAT6、NF-κB蛋白表達

3 討 論

PM2.5是氣道炎性反應及黏液高分泌狀態發病機制中的主要病因，會增加氧化應激(氧化劑/抗氧化劑失衡)和炎癥〔11〕。國外研究描述了一種大鼠模型系統，其長期暴露于PM2.5可以導致慢性氣道疾病的發生，氧化應激加劇，其證據是一氧化氮(NO)水平升高和谷胱甘肽(GSH)降低；彌漫性肺部炎癥；杯狀細胞化生及氣道中嗜中性粒細胞、T和B淋巴細胞、單核細胞和未成熟巨噬細胞的數量增加。黏膜纖毛系統由分泌黏液的杯狀細胞和纖毛細胞組成，并產生一層連續翻轉的保護性黏液層，襯在氣道上皮上〔12〕。杯狀細胞的分化和黏液的產生受到廣泛控制，黏液分泌過多可能是哮喘惡化的關鍵原因，且可以通過多種細胞內信號傳導途徑引發。MUC5AC和MUC5B是進化上保守的基因，編碼與結構相關的黏蛋白糖蛋白，是氣道黏液中的主要大分子〔13〕。MUC5AC的過量生產也是哮喘的另一個疾病特征〔14，15〕。MUC5AC是氣道高反應性(AHR)所需的過敏性炎癥主要效應器，抑制MUC5AC可能是治療哮喘的有效方法〔16〕。本研究PM2.5致大鼠氣道炎性反應及黏液高分泌狀態模型建立成功。

黃芩素可能通過細胞外調節蛋白激酶(ERK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)途徑起作用，從而有效抑制IL-1β誘導的人氣道上皮NCI-H292細胞中MUC5AC基因表達〔17〕。在最近的一項研究〔18〕中，黃芩素處理后，暴露于彈性蛋白酶-脂多糖(LPS)的小鼠與未經預處理的暴露小鼠相比，氧化應激、肺部炎癥、杯狀細胞化生及促炎細胞因子和MUC5AC的mRNA表達降低。此外，發現黃芩素治療可防止暴露于彈性蛋白酶/LPS的小鼠發生氣腫，這種預防與減少氧化應激、肺部炎癥和基質金屬蛋白酶(MMP)活性有關〔18〕。本研究結果與上述討論一致，同時說明，黃芩素對PM2.5致大鼠氣道炎性反應及黏液高分泌狀態有明顯抑制作用。

STAT6/NF-κB信號傳導在多種細胞功能中起重要作用，如細胞遷移和增殖，平滑肌細胞收縮和基因表達。NF-κB是STAT6的效應分子，并參與STAT轉錄活性。STAT6是G蛋白耦聯受體激活非受體酪氨酸激酶(JAK)/STAT信號傳導所必需的。最近研究表明，STAT6信號級聯導致細胞毒素壞死因子(CNF)和CNF3中毒誘導的STAT3激活〔19〕。報道還表明，Rho激酶抑制作用減弱了由慢性炎癥引起的氣道反應性、炎癥、基質重塑和氧化應激活化。STAT6激酶抑制劑通過抑制肌球蛋白輕鏈磷酸化和肌動蛋白解聚來調節平滑肌松弛〔20〕。STAT6激酶在哮喘的過敏模型中已顯示出增加的STAT6/NF-κB活性。STAT6/NF-κB信號通路對于增加平滑肌的鈣離子(Ca2+)敏感性很重要。NF-κB抑制劑可作為COPD的治療藥物〔21〕。NF-κB調節AHR，NF-κB在變應原誘導的杯狀細胞增生中起作用。NF-κB對于調節嗜酸性粒細胞炎癥和杯狀細胞增生很重要。STAT6信號通過血小板P2Y受體控制過敏性小鼠中的白細胞募集〔22〕。Fasudil是一種選擇性的STAT6激酶抑制劑，可降低用fasudil治療的大鼠心臟組織中NF-κB和STAT6水平〔23〕。Fasudil抑制了過表達銅鋅超氧化物歧化酶1的轉基因小鼠中NF-κB活性的升高。本研究結果說明黃芩素能抑制大鼠氣管組織STAT6、NF-κB mRNA和蛋白的表達，進而抑制STAT6/NF-κB信號通路激活，從而起到抗炎及抗黏液高分泌的作用。

綜上，黃芩素對PM2.5致大鼠氣道炎性反應及黏液高分泌狀態有明顯抑制作用；其機制與黃芩素能抑制大鼠氣管組織STAT6、NF-κB mRNA和蛋白表達，進而抑制STAT6/NF-κB信號通路激活有關。