四黃油對糖尿病大鼠燙傷創面皮膚組織CD146、VEGF表達及肉芽組織血管密度的影響

黃衛虎 徐燕 孫朝越 張瑋 王霞

(1吉安市中心人民醫院醫學美容科,江西 吉安 343000;2井岡山大學附屬醫院檢驗科;3井岡山大學醫學部)

糖尿病合并燙傷不僅給患者帶來了巨大的精神壓力，同時嚴重損害患者的生活質量并造成經濟負擔〔1〕。盡管已證明負壓引流、抗感染敷料和生長因子可部分改善燙傷創面的愈合，但專注于最小化傷口或促進細胞增殖的單一治療方法仍無法獲得令人滿意的結果。傷口修復是一個復雜而有序的生物學過程，包括止血、炎癥反應、細胞增殖和組織重塑〔2〕。在任何一個階段中出現問題都可能延遲傷口愈合。糖尿病患者的高血糖微環境很可能導致與愈合相關的生長因子分泌減少，導致成纖維細胞增殖減少，這是延遲糖尿病潰瘍愈合的最有害因素之一〔3，4〕。血管內皮生長因子(VEGF)在調節傷口修復、胚胎發育、血管生成和神經修復中起重要作用〔5〕。有研究〔6～8〕表明，當上皮組織受損時，VEGF在傷口表面過度表達，刺激成纖維細胞、膠原蛋白和結締組織積聚到傷口部位，從而產生新組織并促進傷口愈合。在糖尿病慢性潰瘍中，高葡萄糖水平通常會誘發過多的炎癥因子的產生，從而導致炎癥反應延長，由于炎癥滲出物的積累而破壞傷口的微環境及細胞損傷。CD146是血管形成的重要標志，新生血管的CD146呈高表達，抗CD146抗體標記能很好地區分新生血管和成熟血管，根據CD146表達計算出的微血管密度(MVD)是新生血管形成的量化指標〔9〕。研究表明〔10～12〕，細胞黏附分子CD146是腫瘤新生血管的標志物分子，能夠促進VEGF信號這一血管生成中最為重要的信號通路的傳導，進而促進血管生成。同時，CD146在調節炎癥方面顯示出優異的功效。就相應的作用機制而言，CD146通過抑制核轉錄因子(NF)-κB信號通路來抑制巨噬細胞介導的炎癥反應。因此，使用CD146改善炎癥微環境，結合VEGF促進細胞增殖，可能代表一種有效的治療方法，可促進糖尿病性潰瘍患者的傷口愈合。四黃油由四黃(黃連、黃柏、黃芩和黃杞子)、紅花、血蝎、白芷、等中藥浸泡于香油，經煎煮提煉而成。它有獨特的多功能，并且已被證明具有良好的生物相容性和低刺激性。使用四黃油治療慢性皮膚潰瘍的優勢包括其對水和氣體的雙向滲透性及其是防止細菌入侵和感染的有效屏障。另外，四黃油顯示出良好的可塑性和黏附性，從而延長了藥物在皮膚表面上的停留時間。本研究探討四黃油對糖尿病大鼠燙傷皮膚組織CD146、VEGF表達及肉芽組織血管密度的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 24只雄性SPF級SD大鼠，7～9周齡，體重210～240 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物公司。動物生產許可證號碼為：SCXK(湘)2009-0004。為所有大鼠自適應地在籠子中提供飲用水和固體鼠糧。室溫約23℃，相對濕度為60%，光/暗周期為12 h/12 h。所有大鼠適應性飼養4 w，在此期間測量并記錄血糖水平。

1.2糖尿病模型建立及燙傷創面制備 ①建立大鼠糖尿病模型：腹腔內一次性注射經檸檬酸緩沖液稀釋的鏈脲佐菌素(STZ)55 mg/kg；注射后每日檢測血糖，當血糖>13.3 mol/L(基礎血糖<8.9 mol/L)，胰腺組織病理學檢查證實胰島細胞已破壞，則表明建模成功。②Ⅱ度燙傷創面制備：糖尿病模型成功建立后1個月，3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，每只大鼠的背部用脫毛劑脫毛，在脊柱兩側燙傷(每個直徑1.0 cm)。燙傷條件如下：熱頭溫度為85℃，作用在皮膚上的力等于0.5 kg重量，持續10 s，傷口不做包扎，將每只大鼠單獨隔離，并提供普通飲食。在傷口形成當天開始進行各種治療。在開始四黃油治療之前，用過氧化氫對傷口進行適當處理，并用碘伏消毒。

1.3動物分組 將24只深Ⅱ度燙傷糖尿病大鼠隨機分為實驗組和對照組，每組12只。實驗組：燙傷后即刻，創面局部涂抹四黃油。對照組：于相同時間點，創面局部涂抹等量香油。治療持續31 d。在第7、14、25和31天，使用數碼相機為傷口拍照，并通過Image Pro plus V6.0分析傷口的愈合過程。在每個時間點計算傷口愈合率。

1.4Western印跡檢測蛋白表達 通過二喹啉甲酸(BCA)試劑對動物或細胞中的蛋白質進行定量，并加入等量的蛋白質(體外40 μg)。將提取的蛋白質與上樣緩沖液混合，煮沸并在-20℃保存。另外，將20 μl包含40 μg總蛋白質的蛋白質混合物上樣到12%聚丙烯酰胺凝膠上，80 V電泳分離。2 h后，將分離的蛋白質電轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。隨后，使用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜90 min。隨后，添加相應的一抗和探針，并將樣品在4℃孵育過夜。一抗包括以下抗體：α-SMA、膠原Ⅲ、泛角蛋白、VEGF、CD146、轉化生長因子(TGF)-β、白細胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-10。接下來，將樣品與相應的二抗(山羊IgG、抗小鼠IgG或與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗兔IgG(1：5 000)在室溫下孵育1 h。隨后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，通過電化學發光(ECL)發光劑檢測信號，并通過ChemiDoc XRS + Imaging System(Bio-Rad)捕獲結果。最后，通過圖像實驗室軟件分析目標波段灰度值。

1.5免疫熒光 將嵌入OCT的組織冷凍，切成10 μm的厚度，并保存在-20℃下直至進一步使用。將冷凍的載玻片在室溫下放置10 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌4次(每次洗滌5 min)，并在37℃下用5%(W/V)山羊血清封閉1 h。吸出過量的山羊血清，并將一抗在4℃下孵育過夜。一抗包括：α-平滑肌肌動蛋白(SMA)、Pan-Keratin和CD146，所有抗體都用1%(W/V)山羊血清稀釋。第二天，將切片在室溫下加熱40 min，用PBS清洗4次(每次清洗5 min)，與特定的第二抗體在黑暗中于37℃放置1 h。將切片用PBS洗滌4次(每次洗滌5 min)，并在黑暗中用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色15 min。在PBS中進行4次連續洗滌(5 min/次)后，將抗熒光淬滅劑PVP添加到組織中以密封玻片。使用Leica激光共聚焦顯微鏡以400倍放大率拍攝每個切片的3個隨機區域。通過Image Pro Plus V6.0分析每個圖像的平均熒光強度。

1.6MVD計數 以抗CD146抗體對標本進行免疫組織化學染色，操作步驟按SP(生物素-鏈霉親和素-辣根過氧化物酶)試劑盒說明書進行。根據CD146表達并參照Pareek等〔13〕的方法計算MVD，以此作為新生血管形成的量化指標。

1.7統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析或重復測量的方差分析、LSD-t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1四黃油可加速傷口閉合并促進大鼠上皮再形成 與對照組同時間點相比，實驗組燙傷皮膚的傷口愈合面積顯著增大(P<0.01)。圖1顯示了2種不同治療方式在第0、7、14、25、31天的燙傷創面。見表1、圖1。第31天，實驗組的表皮厚度顯著大于對照組(P<0.05)。見圖2。

表1 兩組不同時間點燙傷皮膚的傷口愈合面積

圖1 兩組傷口閉合情況

圖2 兩組第31天上皮組織(HE染色，×100)

2.2四黃油通過增加α-SMA表達來增強肉芽形成 將第31天兩組的皮膚組織用于組織學分析。四黃油組的上皮完好無損，真皮層的膠原蛋白排列整齊，沒有明顯的水腫。同時，其外圍區域很好地整合到周圍的天然皮膚組織中，并且觀察到許多皮膚附件和毛囊的形成(圖3A中的藍色箭頭)。而對照組中仍存在真皮水腫(圖3A中的黃色箭頭)，沒有明顯的皮膚附件再生。Western印跡顯示在第25天和第31天，實驗組中α-SMA表達(357.25±49.82，571.19±62.26)明顯高于對照組(211.83±39.38，450.21±35.82，P<0.05)，見圖3B。免疫熒光顯示，與對照組相比，在第31天，實驗組的真皮中α-SMA的表達增加(P<0.05)，見圖3C。

A：皮膚組織第31天免疫組化染色(×100);B:Western印跡檢測α-SMA表達；C:免疫熒光染色(×100)圖3 四黃油通過增加α-SMA表達來增強肉芽形成

2.3四黃油可提高膠原蛋白的合成能力 如圖4A所示，與對照組相比，第25天和第31天實驗組中膠原Ⅲ蛋白表達明顯增加(P<0.05)。如圖4B所示，實驗組第25天、第31天膠原Ⅲ蛋白表達(592.31±52.10，762.17±55.83)較對照組(319.22±40.10，482.19±35.62)明顯增加(P<0.05)。

A：第25天和第31天免疫組化染色(×100)；B：Western印跡檢測膠原Ⅲ蛋白表達圖4 四黃油可提高膠原蛋白的合成能力

2.4兩組肉芽組織微血管密度 免疫組織化學染色顯示，兩組創面均于燙傷后第3天開始出現新生血管；自第7天起，實驗組各時相點創面肉芽組織微血管密度較對照組明顯增加(P<0.01)。見表2。

表2 兩組燙傷皮膚的肉芽組織微血管密度根/mm2，n=12)

2.5四黃油通過增加VEGF和CD146的水平來增加血管生成 圖5A、5B顯示，在第14天，實驗組VEGF表達(338.15±40.92)較對照組(213.59±33.62)明顯增加(P<0.05)。圖5C顯示，在實驗組中觀察到大量新形成的血管(白色箭頭)。在對照組中，僅發現了少數具有CD146表達的內皮細胞。Western印跡結果(圖5D)顯示，與對照組相比，實驗組(526.19±59.26，827.16±71.58)在第14天和第31天的CD146表達水平較對照組(356.57±42.79，518.23±62.55)更高(P<0.05)。

A：免疫組化染色(×100);B：Western印跡檢測VEGF表達；C：免疫熒光(×100)；D：Western印跡檢測CD146表達圖5 四黃油通過增加VEGF和CD146的水平來增加血管生成

3 討 論

新生血管化障礙或延遲是糖尿病創面難愈重要原因之一〔14〕。微血管內皮細胞功能異常在糖尿病早期就已經存在，隨著血糖升高，多元醇通路、二脂酰甘油(DAG)-蛋白激酶(PK)C通路、蛋白質非酶糖基化、氧化應激及胰島素抵抗等多種因素相互影響和累加，使微血管內皮細胞損傷逐漸加重，并最終導致糖尿病微血管病變發生。創面愈合的主要決定性因素是創面新生血管化，四黃油促進創面新生血管化的過程對于創面愈合有著重要的影響〔15〕。四黃油具有較好的促進傷口愈合的作用。本研究結果證實四黃油在促進上皮再生和肉芽形成方面的優勢。四黃油還通過促進CD146和VEGF的表達來促進血管生成。在糖尿病性潰瘍組織中，促炎性細胞因子的表達增加，同時抗炎性細胞因子的表達減少，通常會導致局部潰瘍組織中炎癥信號的丟失或延遲〔16～18〕。該現象被認為代表了糖尿病潰瘍非愈合特性的主要原因之一。新生血管是肉芽組織的重要組成部分，向創傷區域提供營養和運輸代謝產物，在創面愈合過程中扮演重要的角色。在正常創面組織愈合過程中，新生的血管可以為炎癥反應提供氧和養料，并促進巨噬細胞、角質細胞、血管內皮細胞分泌促血管生長因子以加速創面愈合〔19〕。糖尿病性潰瘍是慢性傷口，感染和周圍血管疾病的存在使得對這些傷口的治療要求很高，并且需要多學科的方法〔20〕。本研究表明，四黃油在大鼠燙傷模型中減少了過度的炎癥反應。CD146主要表達于新生血管中，可作為檢測新生血管的有效指標。本實驗發現四黃油具有促進糖尿病創面新生血管再生的作用，通過改善創面的血液供應，促進創面愈合，其機制可能為：①增強創面血管內皮細胞的增殖和遷移能力；②通過趨化浸潤創面的炎癥細胞分泌促血管生長因子，作用于血管內皮細胞，促進創面新生血管的形成。