非布司他對高尿酸血癥大鼠p38 MAPK/NF-κB通路及腦血管粥樣硬化的影響

李芳 姚嘉怡 姚建華 曹京旌 寧曉然

(1河北省人民醫院風濕免疫科，河北 石家莊 050000；2華北理工大學冀唐學院中醫系；3河北醫科大學第二醫院老年病科)

高尿酸血癥(HUA)為一種因尿酸代謝功能障礙引起的慢性代謝疾病，可因尿酸鹽沉積而導致關節痛風發作和尿酸性腎結石，并可引起血管內皮功能異常、動脈粥樣硬化、血管鈣化等心血管功能異常〔1，2〕。研究表明，HUA與腦血管粥樣硬化有著密切聯系〔3〕，而尿酸誘導的氧化應激及炎癥反應是造成腦血管粥樣硬化的主要病理基礎，清除氧自由基，抑制炎癥是對抗上述血管損傷的一種有效治療方法〔4，5〕。p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核轉錄因子(NF)-κB可調控機體炎癥及氧化應激過程，尿酸可增強p38 MAPK的磷酸化，進而激活NF-κB信號，促使其核轉移及促炎因子表達，誘導血管平滑肌細胞炎癥；抑制p38 MAPK/NF-κB激活，可減少活性氧產生，降低炎癥因子表達，減輕動脈血管炎癥損傷，改善動脈粥樣硬化〔6，7〕。因此推測，p38 MAPK/NF-κB信號是治療HUA大鼠腦血管粥樣硬化的主要作用靶點。非布司他作為一種黃嘌呤氧化酶抑制劑，是臨床中用于治療HUA的一線藥物，可降低尿酸水平，對于慢性腎病HUA患者療效確切，安全可靠〔8，9〕，但非布司他對HUA大鼠p38 MAPK/NF-κB通路與其腦血管粥樣硬化的影響，目前還尚未有明確闡述，本文以不同劑量非布司他處理HUA模型大鼠，對此課題進行探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級Wistar大鼠購自南方醫科大學，許可證號為SCXK(粵)2016-0041，雄性，體重200～220 g。在河北省人民醫院動物房中嚴格參照《關于善待實驗動物的指導性意見》飼養，室內環境保持清潔級，噪音不超過80 dB，通風良好，溫度25℃，相對濕度55%，飼養適應1 w后進行實驗。

1.1.2試劑與儀器 非布司他片(規格：40 mg/片)，生產廠家：江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，國藥準字：H20130058；別嘌醇片(規格：0.1 g/片)，生產廠家：上海信誼萬象藥業股份有限公司，國藥準字：H31020334；超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒，生產廠家：上海晶抗生物工程有限公司，貨號：JK-(a)-2293、JK-(a)-2197；兔源p38 MAPK、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、NF-κB p65、磷酸化(p)-p38 MAPK及增殖細胞核抗原(PCNA)一抗、大鼠白細胞介素(IL)-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、耦聯辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗兔二抗，生產廠家：美國Abcam公司，貨號：ab181602、ab1194、ab16502、ab17942、ab18197、ab100772、ab5603、ab205718；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒，生產廠家：北京金克隆生物技術有限公司，貨號：RS3390；氧嗪酸鉀，生產廠家：上海源葉生物科技有限公司，貨號：S17112；BCA試劑盒、蛋白裂解液，生產廠家：上海碧云天公司，貨號：P0011、P0013B等。SHE-3000酶標儀，生產廠家：北京賽爾福知心科技有限公司；KEEBIO-600N電泳儀電源、KEEBIO-HE120水平電泳槽、轉移電泳槽KEEBIO-VE186，生產廠家：上海金鵬分析儀器有限公司；SD-1全自動生化分析儀，生產廠家：成都斯馬特科技有限公司；HM355S全自動輪轉式石蠟切片機，生產廠家：上海涵飛醫療器械有限公司；37XF-PC倒置生物顯微鏡，生產廠家：上海永亨光學儀器制造公司；WD-9413B化學凝膠成像儀，生產廠家：濟南來寶醫療器械有限公司等。

1.2方法

1.2.1大鼠HUA模型制備及分組給藥 遵循文獻〔10〕中方法，將氧嗪酸鉀溶于蒸餾水中，并拌入大鼠飼料中，使氧嗪酸鉀占飼料的質量分數為2%。然后以2%的氧嗪酸鉀飼料喂養65只大鼠，6 w后進行血清尿酸水平檢測，當明顯高于正常飼料喂養大鼠時，即表明HUA模型構建成功，共成功構建模型60只，隨機分為M組、FX-L組、FX-M組、FX-H組、Allo組，每組12只模型大鼠，另取12只大鼠以正常飼料喂養同樣時間，設為NC組。

以生理鹽水溶解非布司他片及別嘌醇片，配制為0.1、0.2、0.4 mg/ml的非布司他〔11〕溶液和2.4 mg/ml的別嘌醇〔12〕溶液，FX-L組、FX-M組、FX-H組與Allo組大鼠分別以上述溶液10 ml/kg的劑量灌胃，M組和NC組以10 ml/kg的生理鹽水灌胃，每天1次，持續21 d。

1.2.2標本采集及腦血管病理形態檢測 末次用藥后24 h，吸入乙醚麻醉大鼠，解剖、開腹，經腹主動脈取血3 ml，4℃，3 000 r/min，離心15 min，吸出上清即能得到各組血清，于-80℃冰箱中儲存備用；將各組大鼠斷頭取出大腦，分離動脈血管，剪取約0.5 cm漂洗后，置于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余血管儲存在液氮中備用。將固定后的腦血管組織依次浸入75%、90%、95%、100%濃度的梯度酒精中進行脫水，取出切片浸入二甲苯中孵育透明后置于熱石蠟中包埋，將得到的石蠟組織塊放入切片機中做常連續切片，得到厚度約為5 μm的切片備用。

1.2.3大鼠血清尿酸、TNF-α及IL-6水平測定和腦血管組織中氧化應激水平檢測 將1.2.2中儲存于-80℃冰箱中的血清置于冰水浴中解凍，以全自動生化分析儀檢測其中尿酸含量，參照ELISA試劑盒說明書的操作步驟測定其中TNF-α、IL-6含量。

分別將1.2.2中的各組腦血管組織剪碎，與蛋白裂解液混勻后勻漿，每個樣品取出一半勻漿液提取總蛋白，剩余一半勻漿液提取核內蛋白，運用BCA法分別測定總蛋白和核內蛋白濃度，步驟具體參照制造商說明書指導操作，每組各取500 μl總蛋白樣品液，使用檢測試劑盒并遵照其制造商說明書指導測得其中SOD、MDA水平，剩下的總蛋白和核內蛋白樣品液后續做蛋白表達檢測實驗。

1.2.4腦血管組織p38 MAPK/NF-κB通路相關蛋白表達檢測1.2.3中剩余的蛋白樣品液，根據蛋白濃度測定結果將其調至各組相同，每組總蛋白和核內蛋白樣品液各取15 μl，變性蛋白后上樣跑十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，通過濕轉將分離膠中全部蛋白移至PVDF膜，將膜浸入5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育2 h，對蛋白非特異抗原進行封閉處理，然后分別以兔源GAPDH、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、PCNA一抗溶液4℃孵育過夜，稀釋比例均為1：2 000，TBST漂洗3次后將各蛋白膜浸入耦聯HRP的山羊抗兔二抗溶液(稀釋比例為1∶1 000)，室溫孵育2 h后TBST漂洗3次，于膜上滴加增強化學發光試劑對顯色蛋白條帶，在凝膠成像儀中采集各組蛋白條帶圖像，并運用Image-J軟件分析圖片，定量各組蛋白灰度值后量化得到其相對表達量。

1.3統計學分析 采用軟件SPSS26.0進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1非布司他對大鼠血清尿酸的影響 與NC組相比，M組血清尿酸明顯升高(P<0.05)；與M組相比，FX-L、FX-M、FX-H組及Allo組血清尿酸明顯降低(P<0.05)，且FX-L、FX-M、FX-H組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；FX-H組與Allo組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2非布司他對大鼠血清中TNF-α與IL-6水平的影響 與NC組相比，M組血清中TNF-α與IL-6水平明顯增高(P<0.05)；與M組相比，FX-L、FX-M、FX-H組及Allo組大鼠血清中TNF-α與IL-6水平顯著降低(P<0.05)，且FX-L、FX-M、FX-H組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；FX-H組與Allo組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3非布司他對大鼠腦血管組織氧化應激的影響 與NC組相比，M組腦血管組織SOD水平顯著降低(P<0.05)，MDA水平顯著升高(P<0.05)；與M組相比，FX-L、FX-M、FX-H組及Allo組大鼠腦血管組織SOD水平均升高，MDA水平均降低，且FX-L、FX-M、FX-H組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；FX-H組與Allo組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組血清尿酸、TNF-α、IL-6、SOD、MDA水平及腦血管組織p38 MAPK/NF-κB通路相關蛋白表達比較

2.4非布司他對大鼠腦動脈血管病理形態的影響 NC組腦動脈血管形態完好清晰，無損傷；M組腦動脈可見血管平滑肌細胞增生，內膜增厚，腔內可見向里凸起的斑塊，并發生變性壞死，血管壁損傷等病理損傷；與M組相比，FX-L、FX-M、FX-H組及Allo組腦動脈血管上述病理損傷減輕，且隨非布司他劑量升高而逐漸減輕；FX-H組與Allo組相比，腦動脈血管上述病理損傷減輕程度無明顯差異，見圖1。

圖1 各組腦動脈血管HE染色結果(×200)

2.5非布司他對大鼠腦血管組織p38 MAPK/NF-κB通路相關蛋白表達的影響 與NC組相比，M組腦血管組織p38 MAPK/NF-κB通路相關蛋白p-p38 MAPK/p38 MAPK、核內NF-κB p65表達明顯增高(P<0.05)；與M組相比，FX-L、FX-M、FX-H組及Allo組大鼠腦血管組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、核內NF-κB p65表達明顯降低(P<0.05)，且FX-L、FX-M、FX-H組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；FX-H組與Allo組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1、圖2。

圖2 免疫印跡檢測各組大鼠腦血管組織p38 MAPK/NF-κB通路相關蛋白表達

3 討 論

近年來，隨著社會發展及生活水平的提高，人們膳食結構發生很大改變，HUA的患病率隨之明顯增加，且患者呈明顯年輕化趨勢〔13，14〕。研究發現，尿酸可減少一氧化氮(NO)合成，誘導炎癥及氧化應激反應，損傷血管，促使血管鈣化，最終導致動脈粥樣硬化，是引發心血管疾病的獨立危險因素〔15，16〕。本文結果表明高血酸可引發嚴重的炎癥及氧化應激反應，損傷HUA大鼠腦動脈血管。

非布司他是一種黃嘌呤氧化酶抑制劑，可通過減少血清尿酸含量達到治療HUA的目的，對尿酸性腎病患者有明顯腎臟保護作用，能明顯改善其腎動脈粥樣硬化程度，還可減輕痛風患者關節炎癥狀〔2，17〕，但非布司他對腦血管粥樣硬化的影響，鮮有報道。別嘌醇是臨床及基礎研究中探索HUA治療方法及機制的常用陽性對照藥。本文結果表明非布司他可減少HUA大鼠血清尿酸含量，抑制炎癥發生發展，降低氧化應激水平，減輕腦動脈血管損傷，改善腦血管粥樣硬化癥狀，并隨劑量升高而作用增強。

p38 MAPK/NF-κB是機體內調控細胞遷移、增殖、衰老及凋亡、炎癥、脂質過氧化反應等生理病理過程的重要信號，在急性呼吸窘迫綜合征大鼠肺組織中，處于激活狀態，此時，p38 MAPK發生磷酸化，NF-κB大量轉入核內，介導下游炎癥因子表達，促使炎癥進展，加重肺組織損傷，而阻滯p38 MAPK/NF-κB傳導，可抑制炎癥反應，減輕肺組織損傷〔18〕。另外p38 MAPK/NF-κB信號還可介導尿酸誘導的血管組織炎癥及過氧化損傷過程，抑制該信號傳導，可阻止炎癥與過氧化反應發生與發展，減輕動脈血管粥樣硬化癥狀〔6，7，19〕。本文結果表明p38 MAPK/NF-κB參與介導HUA大鼠腦血管粥樣硬化病理過程，非布司他可下調該信號表達，降低血清尿酸水平，改善HUA大鼠腦血管粥樣硬化癥狀。

綜上，非布司他可抑制尿酸合成，減輕p38 MAPK磷酸化，阻止NF-κB p65核轉移，降低炎性細胞因子TNF-α、IL-6合成分泌，抑制炎癥及氧化應激發生發展，減輕腦血管病理損傷，緩解HUA大鼠腦血管粥樣硬化癥狀，阻滯p38 MAPK/NF-κB信號傳導可能是其藥理機制之一。但本文只進行了初步研究，證據效力不足，還需通過使用p38 MAPK/NF-κB信號激活劑和抑制劑來進行對照驗證。