馬錢苷對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷神經保護作用及Wnt/β-catenin通路的影響

王璐 付蓉 巫玉娟

(貴陽市第二人民醫院神經內科，貴州 貴陽 550018)

腦卒中是全球死亡和殘疾的主要原因之一，對于缺血性腦卒中患者，在發病后3.0～4.5 h內給予組織纖溶酶原激活劑治療是最有效的方法之一，然而，恢復缺血大腦的血流可能會導致缺血再灌注(I/R)損傷，對缺血大腦造成更嚴重的傷害〔1〕。因此，迫切需要進行探索性研究，以發現改善或預防腦I/R損傷的藥物，尼莫地平是目前常用藥物。中藥歷史悠久，已廣泛用于亞洲許多國家和地區，如補陽還五湯和腦栓通等在實驗動物模型中顯示出有益反應，可減輕I/R損傷〔2〕。馬錢苷是從山茱萸中提取的主要有效成分，具有較強的抗炎和抗氧化能力。研究顯示，山茱萸提取物對缺血性腦損傷大鼠具有神經保護作用，但馬錢苷對I/R損傷的作用研究較少〔3〕。研究發現，腦卒中后神經系統功能的重建涉及許多蛋白質和信號通路，其中Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)信號通路參與腦缺血后的神經發生和功能恢復，阻斷Wnt信號通路可抑制大鼠神經祖細胞(NPC)的增殖和分化〔4〕。β-catenin是Wnt信號通路的關鍵下游介質，它激活涉及中樞神經系統神經元存活和體內穩態的多個靶基因〔5〕。研究表明，刺激Wnt/β-catenin通路可誘導缺血損傷后神經元分化和存活的神經源性環境〔6〕。此外，激活肝臟Wnt/β-catenin通路可通過改善氧化應激和抑制促炎性細胞因子的釋放來減輕I/R損傷〔7〕。因此，Wnt/β-catenin通路是I/R治療的一個很好的潛在靶點。本研究探討馬錢苷對大鼠局灶性I/R的神經保護作用，同時探討Wnt/β-catenin通路在該過程中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級成年SD雄性大鼠購自重慶醫科大學實驗動物中心，8～10周齡，體重(230±20)g，動物生產許可證號：SCXK(渝)2019-0003，動物使用許可證號：SYXK(渝)2019-0016，動物質量合格證號：HR2019001746，在環境溫度(23±2)℃，相對濕度60%～70%，光照12 h明暗交替的環境中飼養，適應性喂養1 w后進行實驗。

1.2主要試劑與儀器 馬錢苷(原料藥，純度99%，成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：M-010-160516)；尼莫地平片(上海世康特制藥有限公司，規格30mg，批號：20191225)；戊巴比妥鈉(上海上藥新亞藥業有限公司，批號：SC-6017)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液(中生北控生物科技有限公司，批號：QM30217S)；大鼠丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(上海生工生物工程有限公司，批號：SK039、YT297)；Trizol試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉錄試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTM熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(大連寶生物工程有限公司，批號：DRR152A、DRR047A、DRR041A)；HBS-1096B型酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司)；CFX96型實時熒光定量PCR儀(美國BD公司)。

1.3造模、分組及給藥 采用線栓法制備大鼠腦I/R模型：大鼠禁食12 h后用3%戊巴比妥鈉(300 mg/kg)進行麻醉后分離勁總動脈、頸內動脈和頸外動脈，結扎頸外動脈遠端后，在頸外動脈上切開一個小切口，將一條絲線插入頸內動脈約20 mm，并結扎，2 h后拔出絲線，以重新供應血流制備再灌注模型〔8〕。將造模成功的48只大鼠按隨機數表法分為模型組、馬錢苷低劑量組、馬錢苷高劑量組和尼莫地平組，每組12只；另取12只大鼠作為假手術組，假手術組只分離血管不進行阻塞血流。造模成功2 h后，假手術組和模型組灌胃生理鹽水(10 ml/kg)；馬錢苷低劑量組和馬錢苷高劑量組分別灌胃50 mg/kg和100 mg/kg馬錢苷〔9〕(將馬錢苷和生理鹽水配制成濃度分別為5 mg/ml和10 mg/ml的溶液，灌胃體積10 ml/kg)；尼莫地平組灌胃20 mg/kg尼莫地平〔10〕(將尼莫地平和生理鹽水配制成濃度為2 mg/ml的溶液，灌胃體積10 ml/kg)，1次/d，連續給藥7 d。

1.4神經運動功能評分〔11〕末次給藥后1 h對大鼠的神經運動功能進行評估：5分：完全無法走路；4分：無法自發行走和失去知覺；3分：走路時向內傾斜；2分：走路時向內旋轉；1分：前爪無法完全伸展；0分：無神經功能障礙癥狀。

1.5腦梗死體積百分比測定 采用脊髓脫臼法處死大鼠，取完整腦組織，將大鼠腦組織行冠狀位切片(2 mm)，2%的TTC染液染色30 min，用Image Pro Plus6.0軟件測定腦梗死體積，計算腦梗死體積百分比，腦梗死體積百分比=腦梗死體積/完整腦組織體積×100%。

1.6ELISA檢測腦組織中MDA和GSH水平 取一塊腦組織，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，用研缽將腦組織研碎，離心取上清，根據試劑盒說明書進行MDA和GSH水平測定。

1.7實時熒光定量-PCR(qRT-PCR)檢測腦組織中Wnt、β-catenin、神經元生成素(Ngn)2、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X 蛋白(Bax)mRNA水平測定 制成腦組織勻漿，加入Trizol試劑進行總RNA的提取，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA。Wnt、β-catenin、Ngn2、Bcl-2、Bax和GAPDH引物由大連TaKaRa公司設計并合成，引物序列，Wnt正向引物:5′-TTCTGAGGAAGAACAGCATGAA-3′,反向:5′-CCTTTTGGAGTCTGACCATTTC-3′；β-catenin正向引物:5′-CTGCTAACTGACCAAAATGACG-3′,反向:5′-AACAGTGGGTAGGTATGATGGC-3′；Ngn2正向引物:5′-AGCGTCAACAGGGAGATG-3′,反向:5′-CTTCAGAGACAGCCAGGAG-3′；Bcl-2正向引物:5′-GGGAGGATTGTGGCCTTCTT-3′,反向:5′-TGTGCAGGTGCCGGTTCAG-3′；Bax正向引物:5′-ATCATGGGCTGGACATTGGA-3′,反向:5′-ACAGGGACATCAGTCGCTTCA-3′；GAPDH正向引物:5′-GCCAAGGCTGTGGGCAAGGT-3′,反向:5′-TCTCCAGGCGGCACGCAGA-3′。制備25 μl反應體系，包括：SYBR? Premix Ex Taq 12.5 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、cDNA模板2 μl、焦碳酸二乙酯(DEPC)水8.5 μl。在95℃預變性1 min，95℃變性30 s，58℃退火5 s，共30個循環，72℃延伸5 s條件下進行擴增，以GAPDH作為內參，采用 2-△△Ct法計算Wnt、β-catenin、Ngn2、Bcl-2、Bax mRNA的相對表達量。

1.8統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組神經運動功能評分和腦梗死體積百分比比較 與假手術組相比，其余各組神經運動功能評分和腦梗死體積百分比均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，馬錢苷各劑量組和尼莫地平組神經運動功能評分和腦梗死體積百分比顯著降低(P<0.05)，且馬錢苷高劑量組神經運動功能評分和腦梗死體積百分比顯著低于馬錢苷低劑量組(P<0.05)；但馬錢苷各劑量組作用效果顯著差于尼莫地平組(P<0.05)。見表1。

表1 各組神經運動功能評分和腦梗死體積百分比比較

2.2各組腦組織中MDA和GSH水平比較 與假手術組相比，其余各組腦組織中MDA水顯著升高，GSH水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，馬錢苷各劑量組和尼莫地平組腦組織中MDA水平顯著降低，GSH水平顯著升高(P<0.05)，且馬錢苷高劑量組腦組織中MDA水平顯著低于馬錢苷低劑量組，GSH水平顯著高于馬錢苷低劑量組(P<0.05)；但馬錢苷各劑量組作用效果顯著差于尼莫地平組(P<0.05)。見表2。

表2 各組腦組織中MDA和GSH水平比較

2.3各組腦組織中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA水平比較 與假手術組相比，其余各組腦組織中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，馬錢苷各劑量組和尼莫地平組腦組織中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，且馬錢苷高劑量組腦組織中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA水平顯著高于馬錢苷低劑量組(P<0.05)；但馬錢苷各劑量組作用效果顯著差于尼莫地平組(P<0.05)。見表3。

表3 各組腦組織中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA水平比較

2.4各組腦組織中Bcl-2、Bax mRNA及Bcl-2/Bax水平比較 與假手術組相比，其余各組腦組織中Bcl-2 mRNA和Bcl-2/Bax水平顯著降低，Bax mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，馬錢苷各劑量組和尼莫地平組腦組織中Bcl-2 mRNA和Bcl-2/Bax水平顯著升高，Bax mRNA水平顯著降低(P<0.05)，且馬錢苷高劑量組腦組織中Bcl-2 mRNA和Bcl-2/Bax水平顯著高于馬錢苷低劑量組，Bax mRNA水平顯著低于馬錢苷低劑量組(P<0.05)；但馬錢苷各劑量組的作用效果顯著差于尼莫地平組(P<0.05)。見表4。

表4 各組腦組織中Bcl-2、Bax mRNA及Bcl-2/Bax水平比較

3 討 論

山茱萸是一種傳統的中藥制劑，其提取物已廣泛用于腦血管疾病研究。馬錢苷是山茱萸的主要活性成分，已有研究證實，馬錢苷通過抗炎和抗氧化作用對神經損傷具有保護作用〔12〕。因為抗氧化劑可以保護嚙齒類動物腦缺血中的Wnt/β-catenin通路，保護NPC的丟失并恢復海馬體在面對全腦輻射時受損的神經發生，所以馬錢苷的神經保護和神經發生促進作用可能部分取決于它的抗氧化能力〔13〕。

Wnt/β-catenin通路在許多細胞事件的調節中很重要，包括預防細胞凋亡及促進細胞再生。在腦組織中，Wnt/β-catenin通路不僅有助于促進神經元存活，而且與神經膠質增殖有關〔14〕。研究表明，在I/R損傷后，Wnt/β-catenin激動劑氯化鋰的給藥對學習和記憶引起神經保護作用〔15〕。相反，缺血性腦卒中后，Wnt/β-catenin通路的拮抗劑Dickkopf(DKK)-1在缺血核心和半影區的神經元中被顯著誘導，并加劇神經元的損害〔16〕。另外，通過小干擾RNA使β-catenin失活會增加成年大鼠腦卒中誘發的梗死體積〔17〕。因此，在腦缺血中激活Wnt/β-catenin通路可能是一個保護性靶點。Wnt蛋白廣泛分布在整個大腦中，是細胞外因子，在發育和成熟的中樞神經系統中起關鍵作用。經典的Wnt信號通路是通過激活其跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled)和低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)-5/6，導致散亂蛋白(Dvl)的激活。Dvl作為細胞質橋接分子，與β-catenin降解復合物(axin/GSK-3/APC)成員互激活，導致復合物解離，使β-catenin產生抗性，細胞質內的β-catenin穩定并進入細胞核，并與轉錄因子(尤其是T細胞因子和淋巴增強因子)結合，以調節靶基因的轉錄〔18〕。Ngn2已被證明是Wnt /β-Catenin信號傳導中重要的神經發生促進因子，促進海馬神經母細胞的分化〔19〕。本研究發現，馬錢苷可增加局灶性I/R大鼠腦組織中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA的表達，從而促進I/R后的神經發生。

易位到細胞核中的β-catenin，可以激活特定基因的表達，如Bcl-2和血管內皮生長因子(VEGF)，從而抑制細胞凋亡。β-catenin通過直接調控Bcl-2表達和以磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AkB)依賴的方式間接抑制Bax來抑制細胞凋亡〔20〕。由于Bcl-2/Bax活性對于細胞凋亡機制的激活/失活至關重要，因此這些蛋白很可能會參與I/R的發病機制〔21〕。Bcl-2通過阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質而具有抗凋亡作用，Bcl-2也中和Bax，防止它破壞線粒體膜。Bcl-2/Bax比值的增加或減少具有抗或促凋亡作用。缺血引起腦組織中Bcl-2水平降低和Bax表達增加，從而導致病變區域神經元丟失〔22〕。與上述研究一致，本研究結果表明馬錢苷在缺血性腦卒中中具有抗凋亡的潛力。

綜上，馬錢苷可改善局灶性I/R大鼠神經功能缺損，其機制可能與馬錢苷激活Wnt/β-catenin通路有關。