Tim-4對kupffer細胞分泌Th1/Th2類細胞因子及抗原呈遞功能的影響

陶勁 何益平 趙常春 樊藝

(重慶市中醫院 1腫瘤科，重慶 400021；2重癥醫學科)

在肝切除、肝移植、肝創傷修復等臨床手術中，肝門阻斷引起肝臟的缺血再灌注損傷幾乎是不可避免的〔1〕，會產生急性炎癥反應進而引起各種病理生理問題，嚴重威脅患者身心健康〔2〕。Kupffer細胞(KCs)是定居于肝血竇內的巨噬細胞，具有吞噬功能、處理和傳遞抗原、調節機體免疫應答等作用〔3〕，其在調節肝臟免疫中起重要作用〔4〕。研究發現，KCs參與介導肝臟再灌注損傷，激活的KCs即可通過高表達核轉錄因子(NF)-κB及表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86等誘導分泌炎癥因子及大量的氧自由基、Th1類細胞因子，引起急性炎癥反應及肝臟缺血再灌注損傷〔5〕，又可通過上調細胞相關自殺因子(FasL)表達，誘導T細胞凋亡及促進Th2分泌細胞因子，進而通過抑制免疫反應負向調控肝臟缺血再灌注損傷〔6〕。T細胞免疫球蛋白黏蛋白(Tim)-4可在KCs表達，在調控機體免疫功能中發揮著重要作用〔7〕。Tim-4與Tim-1相結合，可促進T淋巴細胞向Th2細胞分化，誘導Th1/Th2免疫平衡向Th2偏移，參與哮喘、過敏及自身免疫性疾病的發生、發展過程〔8〕，因此推測Tim-4參與調解KCs的免疫功能。本研究通過過表達Tim-4、Tim-4-shRNAs質粒及Tim-4單克隆抗體處理KCs，探討Tim-4對KCs分泌Th1/Th2類細胞因子及抗原呈遞功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性BALB/c小鼠3只，8～10周齡，體重16～22 g，許可證號：SCXK(川)2017-0041，成都中醫藥大學實驗動物研究中心提供。在自然光照，清潔、安靜的環境下飼養，定時更換飼料、飲水、清理鼠籠。

1.2主要試劑與儀器 TIM-4、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Percoll原液(批號SY0531-CRI)購自北京百奧萊博科技有限公司；小鼠Tim-4Tim-4-shRNAs質粒(批號ABIN3540482)、Tim-4過表達質粒(批號ABIN3336325)購自Genemics-online公司；脂多糖(LPS，批號L8880)、RPMI1640培養基(批號31800)、胎牛血清(FBS，批號11011-8611)、磷酸鹽緩沖液(PBS，批號P1022)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(批號T1300)、100×青鏈霉素混合液(批號P1400)、凝血酶(批號T8021)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒(批號P1200-50T)均購自Solarbio公司；CD80-PE(批號130-102-613)、CD86-PE(批號130-102-604)、CD40-異硫氰酸熒光素(FITC，批號130-102-533)購自上海恒斐生物科技有限公司；MCH-Ⅱ-FITC(批號130-081-601)購自天津泰澤興業生物科技有限公司；Opti-MEM培養基(批號51985091)、LipofectamineTM2000(批號11668019)購自美國Invitrogen公司；卵清蛋白(批號9006-59-1)購自Sigma公司；T細胞分離用尼龍毛柱(批號143-07041)購自上海新睿生物科技有限公司；RNAiso Plus(批號9108)、逆轉錄試劑盒(批號RR037Q/A/B)、熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(批號639519)均購自TaKaRa公司；兔源GAPDH一抗(批號ab181602)、兔源Tim-4一抗(批號ab47637)、兔源CD68一抗(批號ab125212)、羊抗兔二抗(批號ab150077)、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號ab208348)、白細胞介素(IL)-1β ELISA試劑盒(批號ab100704)、IFN-γ ELISA試劑盒(批號ab252352)、IL-10 ELISA試劑盒(批號ab108870)均購自Abcam公司；親和素-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)免疫組化試劑盒(批號PK-6100)購自美國Vector Laboratories公司；膜聯蛋白V(AnnexinV)-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(批號V13242)購自美國Cell Singaling Technology公司；CKK-8試劑盒(批號C0037)、RIPA裂解液(批號P0013K)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(批號P0011)購自碧云天生物技術研究所。Eclipse E200實驗室教學生物顯微鏡購自日本尼康公司；小型垂直電泳系統、Elx800酶標儀購自美國Bio-Rad公司；CFX96 Touch Deep Well熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；3900型高通量DNA合成儀購自美國應用生物系統公司；CytoFLEX流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；Centrifuge 5424R低溫高速離心機購自德國 Eppendorf 股份公司；XB-70制冰機、恒溫水浴鍋，購自上海析達儀器有限公司。

1.3完全培養基的配制及KCs的分離、培養、鑒定 完全培養基：在RPMI1640基礎培養基中加入10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、鏈霉素混合液混勻。參照文獻〔9〕，采用乙醚吸入麻醉BALB/c小鼠，固定于鼠板上，75%酒精噴灑消毒，在無菌操作臺中逐層打開腹腔，暴露下腔靜脈、門靜脈，用10 ml注射器吸入37℃預熱的D-Hank液，穿刺門靜脈近端，剪斷下腔靜脈放血，緩慢灌注肝臟，待肝臟顏色從紅色變成黃白色，改用5 ml 37℃預熱的Ⅳ型膠原酶灌注，然后無菌取得肝臟，以PBS漂洗后剪碎，轉入50 ml離心管中加入10 ml Ⅳ型膠原酶，37℃水浴中孵育消化30 min，200目篩網過濾得細胞懸液，加入PBS至50 ml，4℃離心，300 g，5 min，重復4次，所得細胞沉淀備用。以PBS稀釋Percoll原液得到75%、25%濃度的Percoll液，75%濃度的在底層，25%濃度的在中層，頂層緩慢加入細胞懸液2 ml，4℃離心，500 r/min，15 min，兩層Percoll液層面之間出現一層白色絮狀物，吸管小心吸出，置于另一離心管，加入PBS，4℃離心，300 r/min，5 min，重復1次，取細胞沉淀，加入完全培養基重懸后備用。取上述細胞液接種于24孔板，置于37℃、5%CO2細胞恒溫培養箱中培養，待細胞長至85%左右時，棄去培養液，PBS漂洗，6個孔細胞以4%多聚甲醛固定，加入1%過氧化氫，室溫孵育5 min，加入1.5%血清，室溫封閉2 h，加入CD68一抗，4℃孵育過夜，然后使用ABC免疫組化試劑盒進行免疫組化染色，操作步驟按照說明書，在光學顯微鏡下觀察染色情況并拍照。配制0.4%臺盼藍染液，加入6個培養孔，對細胞進行染色，死亡細胞可被染為藍色，活細胞拒絕藍染，以此觀察判斷細胞活性。

1.4細胞分組1.3中的細胞液接種至12孔板，置于37℃、5%CO2細胞恒溫培養箱中培養過夜后，隨機分為對照組、Tim-4過表達組、Tim-4-shRNAs組、Tim-4單克隆抗體組。Tim-4過表達組、Tim-4-shRNAs組細胞各取50 μl Opti-MEM減血清培養基置于2個Ep管中，分別向其中加入1 μl LipofectamineTM2000、質粒(Tim-4過表達或Tim-4-shRNAs質粒)輕輕混勻，靜置5 min后將2個Ep管中溶液小心混勻，繼續靜置20 min，最后將其加入培養板中處理細胞，6 h后將Opti-MEM培養基換為細胞完全培養基，以100 ng/ml LPS活化〔10〕，在24 h后收集各組細胞及培養基(質粒濃度及處理時間參照說明書及前期預實驗)。Tim-4單克隆抗體組細胞根據抗體說明書的推薦及前期預實驗，以終濃度2.5 μg/ml，的單克隆抗體處理細胞，以100 ng/ml LPS活化，24 h后收集各組細胞及培養基。

1.5qRT-PCR及Western印跡檢測細胞中Tim-4表達 取1.4中收集的細胞，以RNAiso Plus提取總RNA，采用逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，在熒光PCR儀中進行熒光定量PCR，操作步驟，反應體系的配制，反應條件的設定嚴格按照各個試劑盒的說明書進行，使用GAPDH基因作為內參，采用2-ΔΔCt算法分析數據，qRT-PCR引物序列為：GAPDH：正義鏈5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′,反義鏈5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3′；Tim-4正義鏈5′-CTACAGACATAGCCGTACTCA-3′，反義鏈5′-GGATCCGAGAGTGAAGATCCCGTC-3′。取1.4中收集的細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，操作步驟嚴格按照各自說明書進行，各組蛋白根據測定結果調整濃度使之相同，使用SDS-PAGE試劑盒配制濃縮、分離膠，配制方法參照說明書，取20 μg蛋白進行電泳分離，得到的目的蛋白轉移至硝酸纖維膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，兔源GAPDH、Tim-4一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，羊抗兔二抗室溫孵育2 h，以電化學發光(ECL)顯色，使用BioRad系統觀察拍攝條帶，以Quantity one軟件分析結果。

1.6流式細胞儀檢測各組KCs表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40表達水平 取1.4中收集的細胞，加入培養基吹打均勻制成單細胞懸液，計數后調整密度為1×106個/ml，吸取1 ml細胞液置于EP管中，1 000 r/min離心5 min，細胞沉淀加入300 ml緩沖液及抗體CD80-PE、CD86-PE、CD40-FITC、MCH-Ⅱ-FITC輕輕吹打混勻，常溫避光孵育20 min，1 000 r/min離心5 min，然后加入200 ml緩沖液混勻，使用流式細胞儀上機檢測。

1.7ELISA檢測KCs分泌Th1/Th2類細胞因子水平 取1.4中收集的各組細胞培養液，使用ELISA檢測試劑盒檢測細胞因子水平，操作步驟參照說明書。

1.8混合培養KCs及T細胞后T細胞增殖、凋亡的檢測 參照文獻〔11〕，取BALB/c小鼠皮下注入卵清蛋白免疫2次，吸入乙醚麻醉，解剖取出脾臟，剪碎后，加入胰酶消化，過濾后得脾細胞懸液，取小鼠淋巴細胞分離液3 ml置于10 ml離心管中，向其中緩慢加入脾細胞懸液3 ml，2 000 r/min，4℃離心20 min，吸管輕輕吸取分離液與細胞懸液之間的一層白色絮狀物，置于另一離心管中以PBS洗滌細胞2次，4℃離心，1 500 r/min，5 min；加入完全培養基混勻得細胞懸液。根據文獻的方法，細胞懸液使用尼龍毛柱過濾后可得到純化的T細胞。純化的T細胞加入培養基吹打均勻制成單細胞懸液，計數后調整密度為5×105個/ml，將其與1.4中收集的各組KCs以10∶1的比例混合接種在96孔培養板中，培養72 h后，加入CCK-8， 2 h后使用全自動酶標儀中測定450 nm波長下各孔吸光度(OD)，計算各組T細胞的相對增殖率。相對增殖率(%)=處理組OD值/對照組OD值×100%。將5×105個/ml的T細胞與1.4中收集的各組KCs以10∶1的比例〔12〕混合接種在12孔培養板中，培養72 h后，收集懸浮的T細胞，使用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，在流式細胞儀中檢測T細胞凋亡情況，操作步驟參照試劑盒說明書。

1.9統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1KCs鑒定及活性檢測 KCs CD68強表達，免疫組化染色呈現深棕色；KCs呈貼壁生長，形態完整，輪廓清晰，拒絕臺盼藍染色，活性高，見圖1。

圖1 KCs鑒定及活性檢測(×200)

2.2各組KCs Tim-4 mRNA表達 與對照組相比，過表達Tim-4組細胞Tim-4 mRNA及蛋白表達明顯升高(P<0.05)，Tim-4-shRNAs組細胞Tim-4 mRNA及蛋白表達明顯降低(P<0.05)，Tim-4單克隆抗體組細胞Tim-4表達無明顯變化(P>0.05)，見圖2、表1。

1～4：對照組，過表達Tim-4組，Tim-4-shRNAs組，Tim-4單克隆抗體組圖2 各組Tim-4蛋白表達

2.3各組KCs分泌Th1/Th2類細胞因子水平 與對照組相比，過表達Tim-4組細胞分泌Th1類細胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平明顯降低，分泌Th2類細胞因子IL-10水平明顯升高(P<0.05)；Tim-4-shRNAs組、Tim-4單克隆抗體組細胞分泌Th1類細胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平明顯升高，分泌Th2類細胞因子IL-10水平明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組KCs Tim-4 mRNA及蛋白表達和KCs分泌Th1/Th2類細胞因子水平比較

2.4各組KCs表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40表達水平 與對照組相比，過表達Tim-4組細胞表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40表達水平明顯降低(P<0.05)；Tim-4-shRNAs組、Tim-4單克隆抗體組細胞表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40表達水平明顯升高(P<0.05)，見圖3、表2。

2.5各組KCs混合T細胞培養后T細胞增殖、凋亡比較 與對照組相比，過表達Tim-4組T細胞相對增殖率明顯降低，凋亡率明顯升高(P<0.05)；Tim-4-shRNAs組、Tim-4單克隆抗體組T細胞相對增殖率明顯升高，凋亡率明顯降低(P<0.05)，見表2、圖4。

表2 各組KCs表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80、CD40、CD86表達和KCs混合T細胞培養后T細胞相對增殖率與凋亡率比較

圖4 各組KCs混合T細胞培養后T細胞凋亡情況

3 討 論

缺血再灌注損傷是導致臨床各種肝臟手術后肝功能受損甚至肝衰竭的重要原因〔13〕。炎癥因子過度表達、炎癥細胞浸潤引起炎癥反應導致細胞凋亡是肝臟缺血再灌注損傷發生的中心環節，KCs在其中發揮關鍵作用〔14〕。KCs可改變促炎及抑炎細胞因子分泌水平、調控Th1/Th2平衡、介導凋亡細胞的吞噬清除等過程〔15〕。KCs是體內最大的抗原提呈細胞群，重要功能是抗原提呈及誘導初始T細胞活化、亞群分化及炎性細胞因子分泌等〔16〕，將LPS活化后的KCs與T細胞共培養，通過檢測T細胞的增殖、凋亡情況可判斷KCs抗原提呈能力。Tim-4選擇性表達于抗原提呈細胞群中，比如髓系來源的樹突狀細胞、巨噬細胞等，在機體免疫功能調控中發揮重要作用，Tim-4是Tim-1的天然配體，Tim-1優先表達于 Th2 細胞表面，兩者相結合，可激活Th2細胞，使之分泌IL-10抑炎因子，減輕炎癥反應〔17〕。Tim-4還可與凋亡細胞表面分子(PtdSer)結合，促使凋亡抗原特異性T細胞及時有效清除凋亡細胞〔18〕，并可促進巨噬細胞分泌免疫抑制因子，誘導Th17/Treg細胞向Treg偏移，從而發揮免疫負調控效應〔19〕，參照以上研究，可推測Tim-4可調控KCs分泌Th1/Th2類細胞因子及其抗原呈遞功能。本研究結果表示研究中分離得到的KCs純度高，活性好，為后續研究提供了堅實基礎。

本文后續研究結果表明，上調Tim-4可促使活化的KCs分泌IL-10，抑制其分泌TNF-α、IL-1β、IFN-γ，抑制其表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40表達，活化的KCs與T細胞共培養后，上調Tim-4可抑制T細胞增殖，促使其凋亡。IL-10為Th2類抑炎因子，TNF-α、IL-1β、IFN-γ為Th1類促炎因子〔20〕，本文研究結果揭示Tim可誘導活化的KCs因子分泌譜向Th2類細胞因子偏移，減輕炎癥反應，降低其抗原呈遞功能，對免疫起負調控作用。下調Tim-4可逆轉上述作用，為臨床預防及治療肝臟缺血再灌注損傷提供了新思路，但本文對Tim-4調控KCs抗原提呈功能的研究僅限于現象觀察，其詳細分子作用機制尚有待進一步探索。