水飛薊素通過JAK/STAT信號通路抑制老年非酒精性脂肪肝大鼠肝細胞增殖

李鑫 王文川 殷建敏 張清格 李保義 馮子峰 岳亞光

(邢臺市人民醫院 1中西醫結合肝病科 ，河北 邢臺 054001；2超聲科；3邢臺市愛爾眩暈耳鳴耳聾研究所；4邢臺市人民醫院消化內科)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是不存在顯著酒精消耗的前提下慢性肝病的一個主要原因，從良性脂肪蓄積、不同程度的肝臟炎癥(肝炎)、進行性纖維化，并最終發展為肝硬化和終末期肝病甚至肝癌〔1〕，并且常常與胰島素抵抗、向心性肥胖、2型糖尿病和血脂異常密切相關〔2,3〕。由于這些并發癥的流行，NAFLD被公認是世界范圍內的主要健康問題，并且是西方國家肝臟疾病的主要原因，其患病率高達33%〔4〕。與此同時，在東部國家，NAFLD患病率也在增加，這間接反映了這些地區肥胖癥和與肥胖相關疾病的發生率在不斷上升〔5〕。迄今為止，飲食調整和增加體育鍛煉的結合仍然是NAFLD管理的主要方式〔6〕。然而不幸的是，從長期來看，許多患者尤其是老年患者難以改變生活方式。所以探索新的治療老年NAFLD的方法及充分理解現存NAFLD藥物對老年患者的病理機制是當下科研界亟待解決的難題。

水飛薊素(silymarin)是從水飛薊植物的干燥種子和果實中提取的化合物，主要成分為黃酮木聚糖，類黃酮(紫杉醇，槲皮素)和多酚〔7〕，可以清除自由基和抑制脂質過氧化，是一種天然抗氧化劑〔8〕。silymarin通過降低氧化應激反應和隨之而來的細胞毒性，可以保護完整的肝細胞或尚未受到不可逆損傷的細胞，因此被認為具有肝保護作用〔9〕。研究顯示，在大鼠NAFLD形成的過程中伴隨肝細胞增生〔10〕，而細胞無限增生是最終導致癌癥的罪魁禍首。silymarin早在癌細胞中就表現出抗增殖活性的作用〔11〕，然而尚無研究報道其在NAFLD模型中具有抗增殖活性的作用。因此本研究旨在探究silymarin對老年NAFLD大鼠肝細胞增殖的抑制作用。Janus激酶(JAK)和信號傳導及轉錄激活蛋白(STATs)信號通路對于細胞增殖、凋亡，胚胎發育，肝臟再生，糖酵解和炎癥反應，上皮間質轉化及血管生成異常重要〔12〕。STAT3是一種轉錄因子，在細胞的生存、增殖和遷移中起著重要作用，因此被認為是抗細胞增殖相關的治療靶點〔13〕。盡管JAK/STAT信號通路在細胞增殖中發揮了重要作用，但尚無研究指出silymarin是否通過JAK/STAT信號通路影響NAFLD肝細胞的增殖。本研究擬通過建立老年大鼠NAFLD模型，探討 silymarin對NAFLD大鼠肝細胞增殖的影響及是否引起JAK/STAT信號通路的改變，進一步揭示silymarin治療NAFLD疾病的機制。

1 材料和方法

1.1大鼠NAFLD模型的制備 45只清潔級老年雄性SD大鼠(7～8個月，680～720 g)。將大鼠隨機分為3組(n=15)：對照(control)組、模型(NAFLD)組、silymarin組，分別喂養基礎飼料、高脂飼料(含基礎飼料77%、豬油20%、膽固醇1%、膽鹽2%)；從第8周開始，silymarin組在給予高脂飼料的基礎上腹腔注射給藥silymarin 30 mg/kg，1次/d，連續給藥12 w。試驗結束時，頸總動脈放血處死大鼠，取血清和肝臟組織，備用。

1.2組織學分析 取合適大小的肝組織在甲醛溶液中固定48 h，包埋在石蠟中，制成4 μm厚度的石蠟切片。用蘇木素-伊紅(HE)進行染色，光學顯微鏡觀察肝臟組織病理改變。

1.3血清生化指標水平測定 試驗結束后，大鼠禁食12 h，頸總動脈取血，4 000 r/min離心15 min取上清，通過相應的檢測試劑盒按照按說明書操作對大鼠血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、三酰甘油(TG)和總膽固醇(TC)水平進行檢測。

1.4肝細胞提取 取肝臟組織，切下適當大小的肝組織塊，剪去包膜，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，剪碎，PBS清洗。加入消化液于4℃冰箱消化組織，次日，加入含有胎牛血清的RPMI1640培養基終止消化。使用篩網過濾細胞，1 000 r/min 離心5 min，沉淀收集于RPMI1640 培養液(含15%胎牛血清、100 U/L青霉素鈉鹽及100 mg/L硫酸鏈霉素)中培養。

1.5細胞增殖的測定 制備細胞懸液。檢測細胞增殖活力，操作步驟按照CCK-8試劑盒說明書進行。細胞按70%～80%濃度鋪于96孔板，待細胞完全貼壁后，每孔加入CCK8 試劑10 μl，置于細胞培養箱孵育3 h，分別于24、48、72 h 時間點用酶標儀檢測其OD450值。

1.6細胞克隆形成實驗 將適量細胞接種在6孔板，在CO2孵箱中孵育2 w，培養至合適濃度之后，用PBS洗滌2次，用0.5%結晶紫染色。在顯微鏡下計數形成的細胞菌落數，克隆形成效率=(菌落數/接種的細胞數)×100%。

1.7qRT-PCR檢測相關基因mRNA水平變化

1.7.1細胞總RNA的提取 各組大鼠肝細胞于細胞培養瓶培養至80%密度后，收集細胞，加入Trizol試劑(Invitrogen)提取細胞總RNA，用NanoDrop ND-2000進行定量，檢測總RNA的質量和濃度。

1.7.2逆轉錄 向1.5 ml EP管中加入500 ng/μg模板RNA，加入逆轉錄酶利用隨機引物合成cDNA，逆轉錄的反應條件為：25℃ 10 min，50℃ 45 min，85℃ 5 min。

1.7.3qRT-PCR qRT-PCR體系共20 μl含cDNA模板1 μl，SYBR-green 10 μl，Primer mix 8 μl，DEPC 水1 μl，利用SYBR Green PCR試劑盒，加入細胞周期蛋白(Cyclin)D1特異性引物定量其mRNA的表達水平，引物序列如下：上游引物：GAPDH:上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；CyclinD1:上游引物：5′-GCGTACCCTGACACCAATCTC-3′，下游：5′-CTCCTCTTCGCACTTCTGCTC-3′。通過7500-Fast實時PCR系統上機檢測。反應條件為：95℃ 5 min，然后在95℃ 10 s和60℃ 30 s進行40個循環。利用ΔΔCt法進行結果分析。

1.8Western印跡分析相關蛋白水平 使用放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液裂解細胞，充分震蕩并刮取細胞，超聲破碎細胞，12 000 r /min、4℃離心10 min后收集上清液，二喹啉甲酸(BCA)法測量蛋白濃度。取30 μg蛋白溶液，加入適量上樣緩沖液，沸水煮沸5 min，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結束后將凝膠中的蛋白轉入聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗抗體4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌之后，使用辣根過氧化物酶(HRP)標記的特異性二抗常溫孵育1 h，加入電化學發光(ECL)試劑避光顯影。

1.9統計學分析 采用SPSS22.0和GraphPad Prism7.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1肝臟組織病理學檢測結果 control組肝臟組織正常，肝細胞規則排列，而NAFLD組肝臟組織出現典型的脂肪變性，肝細胞膨脹，大量脂肪空泡形成，伴有輕度至中度炎癥浸潤。Silymarin組肝臟病變程度較NAFLD組有明顯好轉。見圖1。

圖1 各組肝臟組織(HE染色，×40)

2.2各組血清生化指標水平比較 NAFLD組血清ALT、AST、TG、TC水平明顯高于control組(P<0.05)；與NAFLD組相比，silymarin組上述指標明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清生化指標水平比較

2.3肝細胞增殖檢測結果 與control組相比，NAFLD組48 h后肝細胞增殖活性明顯升高；與NAFLD組相比，silymarin組48 h后肝細胞增殖活性明顯降低(P<0.05)。見表2。與control組相比，NAFLD組肝細胞集落數目、CyclinD1 mRNA和蛋白水平均顯著增加(P<0.05)；與NAFLD組相比，silymarin組細胞集落數目、CyclinD1 mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)。見表3、圖2、圖3。

表2 各組肝細胞活力檢測結果

表3 各組細胞集落數目及CyclinD1 mRNA蛋白表達

圖2 各組細胞克隆形成實驗

圖3 Western印跡檢測各組CyclinD1蛋白

2.4肝細胞JAK/STAT通路水平變化 NAFLD組與control組肝臟組織JAK2、STAT3蛋白表達無明顯變化(P>0.05)；NAFLD組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達均明顯高于control組(P<0.05)，silymarin能明顯抑制p-JAK2、p-STAT3蛋白水平的升高(P<0.05)。見圖4、表4。

圖4 各組肝細胞JAK2、STAT3蛋白及磷酸化表達

表4 各組肝細胞JAK2、STAT3蛋白及磷酸化表達變化

3 討 論

NAFLD是代謝綜合征的肝臟表現〔14〕，并且正在迅速成為全世界最常見的肝病〔15〕。老年人因為存在肥胖、代謝速率慢、活動少、血脂水平升高等特點，成為NAFLD的高發人群。中國老年人口每年以3.3%的速度增長〔16〕。

silymarin作為幾乎無毒無害的天然藥物，具有較強的肝臟保護作用，通常被用作治療代謝性肝損傷、肝纖維化等疾病〔17〕。NAFLD有發展為肝硬化、肝癌的風險，NAFLD患者存在肝細胞的增生，而細胞過度增生是導致癌癥的主要原因。JAK2/STAT3信號通路對于細胞增殖發揮至關重要的作用〔18,19〕，阻斷JAK2和STAT3磷酸化可減輕肝細胞脂肪變性〔20〕。本研究結果說明silymarin可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活抑制老年NAFLD大鼠肝細胞的過度增殖，從而達到對NAFLD患者的肝臟保護作用。

綜上，silymarin能夠抑制NAFLD大鼠肝細胞的增殖，從而緩解肝臟損傷。其機制可能是通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活。