LncRNA HEIH 對膠質瘤細胞侵襲能力的影響及機制

田少輝 張學浩 徐江龍 喬曉霞 張雨豪 徐燦 李春暉

(河北大學附屬醫院神經外科，河北 保定 071000)

膠質瘤是最常見的中樞神經系統惡性腫瘤,由于腫瘤細胞高度的侵襲性,患者死亡率居高不下。因此，探討和揭示調控膠質瘤轉移的關鍵基因和信號分子對于提高患者預后意義重大。隨著高通量RNA測序技術的發展，RNA測序提示70%～90%的人類基因組被轉錄成RNA，而其中約68%的轉錄子為不能編碼蛋白質的非編碼RNA〔1,2〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度不小于200 nt的非編碼RNA，能夠以“分子海綿”的形式吸附miRNA影響其對下游靶基因的調節作用,或通過與蛋白質結合參與蛋白質相互作用〔3,4〕。有研究報道LncRNA在多種病理生理過程中發揮重要作用〔5,6〕。LncRNA在多種腫瘤中異常表達，并且參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移〔7～9〕。研究表明LncRNA HEIH在肝癌組織和細胞中高表達，促進肝癌細胞生長、侵襲、轉移〔10〕。在結直腸癌中LncRNA HEIH高表達，通過與miR-939相互作用，促進結直腸癌細胞增殖，抑制其凋亡〔11〕。另有證據顯示LncRNA HEIH促進非小細胞肺癌生長和轉移〔12〕。LncRNA HEIH是一類促進腫瘤生成和進展的基因。研究表明多種LncRNA在膠質瘤組織中異常表達影響膠質瘤的發生發展〔13〕。然而，目前尚不清楚LncRNA HEIH對膠質瘤細胞表型和功能的影響及相關的調控機制。本研究旨在闡明LncRNA HEIH在膠質瘤細胞侵襲、轉移中的作用和調控機制。

1 材料與方法

1.1膠質瘤組織細胞系 21例人腦膠質瘤組織取自河北大學附屬醫院神經外科，以16例同期手術的腦膜瘤樣本作為陰性對照。取材前患者均已簽署知情同意書，并經河北大學附屬醫院倫理委員會批準。

1.2材料 DMEM高糖培養基、胎牛血清、TRIzol試劑盒、脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000 購自美國Invitrogen公司；逆轉錄和實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒購自Takara公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega 公司；Transwell 小室購自美國Corning公司；基質膠購自美國BD公司；E盒結合鋅指蛋白(ZEB)1抗體和GAPDH抗體購自Abcam公司；RIPA裂解液和BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3細胞培養和轉染 膠質瘤細胞系U251細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。U251細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，放在37℃，5%CO2恒溫培養箱中培養，當細胞處于對數生長期時用于實驗。

LncRNA HEIH siRNA及對照siRNA、miR-194-5p模擬物(mimics)及無異序列陰性對照、pmirGLO-HEIH-Wt野生型載體、pmirGLO-HEIH-Mut突變型載體(上海吉瑪制藥技術有限公司)分別用脂質體介導瞬時轉染至膠質瘤細胞U251細胞中，具體方法按照LipfectamineTM2000 轉染試劑盒說明書進行操作。轉染48 h后，qRT-PCR驗證轉染效率。

1.4qRT-PCR 采用Trizol試劑按其說明書提取細胞總RNA，按照TakaRa公司qRT-PCR反轉錄試劑盒說明書操作逆轉錄成cDNA。在ABI7500熒光PCR儀進行熒光定量PCR測定LncRNA HEIH、miR-194-5p的相對表達水平。LncRNA HEIH上游引物:5′-CCTCTTGTGCCCCTTTCT-3′，下游:5′-AGGTCTCATGGCTTCTCG-3′；miR-194-5p，上游引物：5′-ATGGACCTGGGGCCAGCGAAG-3′,下游:5′-TCTGGCCTGGGAGCGTCG-3′；ZEB1上游引物：5′-TTCGGAAAGAGCTGTTCGCT-3′，下游:5′-TGCAGCGATCAAGAACCTCT-3′；GAPDH上游引物：5′-CCTGACCTGCGTGTGGACT-3′,下游:5′-GCTGTGGATGGGGAGGTGTC-3；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCCACA-3′，下游:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6或GAPDH為內參，用2-ΔΔCt法分別計算LncRNA HEIH、miR-194-5p和ZEB1的相對表達量。

1.5細胞侵襲實驗 將20 μl基質膠均勻涂在Transwell小室內面，使基質膠凝固。向24孔板中加入600 μl含有10%血清的DMEM高糖培養液，孔內放置Transwell(8 μm)小室。向小室內加入轉染si-LncRNA HEIH(si-HEIH組)或對照siRNA(si-Ctrl組)的U251膠質瘤細胞(2.5×104個)，放入37℃，5%CO2恒溫培養箱中培養。24 h后取出小室，用棉簽將上室內面沒有侵襲過去的細胞去掉，4%多聚甲醛固定30 min，晾干后用結晶紫染色液染色30 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，擦去上層細胞，在顯微鏡下拍照。每個孔隨機選擇5個視野拍照，計數每張相片細胞數，計算平均數進行比較。

1.6生物信息學分析 利用生物信息學數據庫Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)，TargetScan(http://www.targetscan.org)預測LncRNA HEIH 和miR-194-5p的靶基因。

1.7雙熒光素酶報告基因試驗 胰酶消化收取處于對數生長期的U251細胞，接種于不含雙抗的DMEM高糖培養液6孔板中。分組如下：pmir-GLO-HEIH-Wt+miR-194-5p mimics組、pmiR-GLO-HEIH-Wt+mimics組、pmiR-GLO-HEIH-Mut+miR-194-5p mimics組、pmiR-GLO-HEIH-Mut+mimics組，每組設3 個復孔,混合均勻后按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書操作進行共轉染，24 h后按照雙熒光素酶檢測試劑盒產品說明書操作檢測熒光強度。

1.8Western印跡 按照每1.0×106個U251細胞加入100 μl RIPA蛋白裂解液，混勻后置冰上30 min，4℃ 14 000 r/min離心30 min。上清轉入潔凈EP管，采用BCA蛋白定量分析檢測蛋白含量。將轉有蛋白的聚偏氟乙烯(PVDF)膜置于5%脫脂奶粉-TBST室溫中振蕩封閉1 h，然后置于1∶2 000稀釋的,兔抗人ZEB1抗體(ab203829，Abcam)中4℃孵育過夜；第2天室溫用1×TBST洗滌PVDF膜，將膜置于適當稀釋的含辣根過氧化物酶標記二抗的1×TBST中，室溫孵育1 h；用1×TBST洗滌后，進行化學發光操作，伯樂公司Chemic Doc XRS系統曝光，顯影。

1.9統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1LncRNA HEIH在膠質瘤中高表達且影響U251細胞侵襲 與正常星形膠質細胞(1.00±0.08)比較，膠質瘤細胞 U-251中 LncRNA HEIH表達明顯升高(2.53±0.36，P<0.01)。轉染si-HEIH后U251細胞LncRNA HEIH表達顯著降低 (1.00±0.11 vs 0.34±0.03，P<0.01)。與si-Ctrl組相比，si-HEIH組U251細胞侵襲能力顯著降低〔(101.57±11.43) vs (53.56±5.35)個，P<0.01，n=9〕，見圖1。

圖1 沉默LncRNA HEIH抑制U251細胞侵襲 (結晶紫染色，×200)

2.2miR-194-5p是LncRNA HEIH靶基因 利用Starbase數據庫預測LncRNA HEIH靶基因發現，miR-194-5p與LncRNA HEIH有結合位點(圖2)。雙熒光素酶報告基因試驗結果顯示，與miR-NC+HEIH-Wt組相比，miR-194-5p+HEIH-Wt組細胞熒 光 素 酶 相 對活性顯著降低(1.00±0.07 vs 0.34±0.03,P<0.01)，而miR-NC+HEIH-Mut組和miR-194-5p+HEIH-Mut組細胞熒光素酶相對活性無明顯差異(0.99±0.06 vs 0.99±0.06,P>0. 05)。與si-Ctrl組相比，si-HEIH組miR-194-5p表達顯著升高(1.00±0.09 vs 3.04±0.23,P<0. 01)。pcDNA-HEIH組U251細胞中miR-194-5p的表達水平顯著低于 pcDNA組( 0.34±0.03 vs 1.00±0.05,P<0.05)。

圖2 Starbase數據庫預測LncHEIH與miR-194-5p結合位點

2.3miR-194-5p抑制U251細胞ZEB1表達和侵襲 Targetscan數據庫預測發現miR-194-5p與ZEB1有靶向結合位點，見圖3。與miR-NC組(1.00±0.05 )相比，miR-194-5p組U251細胞ZEB1的表達水平顯著降低(0.25±0.03，P<0.01)，見圖4。細胞侵襲實驗結果顯示，與miR-NC組〔(99.52±9.27)個〕相比，miR-194-5p組U251細胞侵襲數量顯著減少〔(45.61±6.05)個，P<0.01〕，見圖5。

圖3 Targetscan數據庫預測mir-194-5p與ZEB1的結合位點；qRT-PCR

圖4 Western印跡

圖5 檢測mir-194-5p對ZEB1表達的影響(結晶紫染色，×200)

2.4miR-194-5p部分逆轉LncRNA HEIH對ZEB1表達和侵襲能力的影響 與pcDNA-HEIH+miR-NC組相比，pcDNA-HEIH+miR-194-5p組U251細胞ZEB1表達和侵襲數量顯著降低(P<0.01)，見圖6、7，表1。

圖6 各組U251細胞侵襲能力(結晶紫染色，×200)

1～3:pcDNA+miR-NC組，pcDNA-HEIH+miR-NC組，pcDNA-HEIH+miR-194-5p組圖7 miR-194-5p逆轉LncHEIH對ZEB1表達

表1 過表達miR-194-5p逆轉LncRNA HEIH對U251細胞ZEB1表達和侵襲能力的影響

2.5敲減ZEB1能逆轉LncHEIH對U-251細胞侵襲的影響 細胞侵襲實驗結果顯示，pcDNA+si-Ctrl組細胞侵襲數量為(96.43±6.34)個。pcDNA-HEIH+si-ZEB1組〔(97.34±5.23 )個〕U251細胞侵襲能力顯著低于pcDNA-HEIH+si-Ctrl組〔(159.78±12.34)個，P<0.01〕，見圖8。

圖8 si-ZEB1逆轉LncHEIH對U251細胞侵襲能力的影響(結晶紫染色，×200)

3 討 論

膠質瘤是常見的中樞神經系統腫瘤，目前對于膠質瘤的治療方法包括手術治療、化療、放療、生物治療等。由于腫瘤轉移和復發，膠質瘤患者生存期很短預后較差。LncRNA在膠質瘤的發生發展中發揮關鍵作用〔14〕。Dai等〔15〕研究發現LncRNA ANRIL通過MAPK信號通路促進膠質瘤發生。Liu等〔16〕報道LINC00909通過調控miR-194/MUC1-C軸促進膠質瘤進展。本研究表明LncRNA HEIH 在膠質瘤組織和細胞中高表達，進一步在體外實驗中發現LncRNA HEIH增強膠質瘤細胞U251侵襲能力，從而證實LncRNA HEIH是一種促膠質瘤LncRNA。miRNA是一種短鏈非編碼RNA分子，在多種腫瘤發生發展中發揮調控作用。有文獻報道miR-194調控腫瘤發展，研究發現miR-194通過調控BMP1和 p27 kip1表達抑制非小細胞肺癌轉移〔17〕。miR-194通過靶向抑制BMI1抑制膠質瘤細胞間質-上皮細胞轉化〔18〕。近年來，有研究顯示，LncRNA可通過競爭性內源RNA途徑，與其他RNA 轉錄本競爭性結合相同的miRNA，從而調控miRNA靶基因的表達。研究表明miR-194在膠質瘤中低表達是LINC00909促進膠質瘤增殖侵襲作用的靶分子〔16〕。本研究結果提示在膠質瘤中，LncRNA HEIH可能通過分子海綿吸附miR-194-5p發揮促癌基因的作用。ZEB1可誘導細胞發生EMT，增強細胞的侵襲轉移能。有研究表明LncRNA-MALAT1可爭性結合miR-200a，上調EC-109細胞中ZEB1、ZEB2的表達，促進食管癌的侵襲和轉移〔19〕。本研究用生物信息學方法預測發現miR-194-5p可能與ZEB1互相結合而調控ZEB1的表達，進一步促進膠質瘤細胞U251侵襲。

綜上所述，LncRNA HEIH通過發揮ceRNA作用，競爭性結合miR-194-5p上調ZEB1表達而促進膠質瘤細胞侵襲。在本研究中，只是用Targetscan數據庫預測ZEB1是miR-194-5p的靶分子，沒有進一步用雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-194-5p與ZEB1直接相互結合。本實驗沒有在動物實驗中驗證LncRNA HEIH對膠質瘤侵襲轉移的影響，這是本研究的局限性。本研究進一步完善了LncRNA在腫瘤發生發展中生物學功能和調控機制，為膠質瘤診斷治療提供新的理論依據。