nAChR激動劑對左旋多巴致老年大鼠帕金森病異動癥的作用

楊虹 成靜 陳芳

(武漢市第四醫院 華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院急診科，湖北 武漢 430034)

帕金森病(PD)是一種主要以黑質多巴胺能神經元變性壞死引起的中樞神經系統退行性病變〔1，2〕。目前PD的一線治療藥物仍是左旋多巴(L-dopa)，它能較好地改善PD所導致的異常運動癥狀和提升患者的日常生活能力，但使用該藥5～10年后主要不良反應異動癥(LID)發病率高達80%〔3，4〕，直接導致患者的運動功能亢進和致殘率的增加〔5，6〕。異動癥的首選治療藥物是金剛烷胺，但它的治療效果欠佳，而且常常因為耐藥性和副作用的發生而停藥〔7，8〕。

有研究顯示非選擇性乙酰膽堿受體(nAChR)激動劑可改善L-dopa所致PD的異動癥，但其具體劑量、使用方法和機制仍不清楚。本研究給予nAChR激動劑腹腔注射老年大鼠異動癥模型，監測與異動癥相關的作用因子和透射電鏡下觀察大鼠紋狀體區神經突觸的超微變化，探索nAChR激動劑對L-dopa致老年大鼠PD異動癥的作用。

1 材料與儀器

1.1實驗動物 選擇體重(220±20)g的(22±2)月齡SD老年大鼠(湖北逸摯誠生物科技有限公司)80只，性別不限。置于(25±1)℃，相對濕度為(50±10)%，在清潔級環境中白天黑夜各12 h喂養1 w，自由進食和飲水。

1.2主要試劑與實驗儀器 主要試劑：6-羥基多巴胺(6-OHDA)、L-dopa、阿撲嗎啡、芐絲肼、nAChR激動劑(Sigma公司)，兔抗大鼠TH(谷歌生物公司)。實驗儀器：腦立體定位儀(美國Stoelting公司)，臺式低溫高速離心機(Sigma公司)，光學顯微鏡(日本Olympus公司)，脫色搖床(杭州佑寧儀器廠)。

1.3大鼠PD模型 大鼠術前禁食12 h，用10%水合氯醛以3 ml/kg速度給予大鼠腹腔注射，麻醉成功后，將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上。局部備皮消毒，依據Paxinos-Watson腦立體定位圖譜〔9〕，大鼠右側前腦內側束(MFB)坐標定位：正中線右側1.5 mm，前囟后4.4 mm，硬膜下7.8 mm。抽取6 μl 6-OHDA溶液，進針至硬腦膜下-7.8 mm處，按0.5 μl/min速度向MFB注射。在手術操作14 d后皮下注射阿撲嗎啡(0.1 mg/kg)，誘導大鼠向對側旋轉，10 min后計算30 min大鼠的旋轉圈數。大鼠PD模型標準：平均旋轉圈數>7圈/min。

1.4大鼠PD異動癥模型 建立L-dopa致大鼠PD異動癥模型：造模成功的PD大鼠每日腹腔注射L-dopa(10 mg/kg)和芐絲肼(2.5 mg/kg)1次，持續14 d。然后每天注射L-dopa 10 min前，給予生理鹽水(1 ml/kg)或nAChR激動劑(0.1 mg/kg)腹腔注射，持續21 d。

1.5異常不自主運動(AIM)評分 AIM分為〔10〕：(1)前肢AIM(2)軸性AIM(3)口面部AIM(4)對側旋轉運動AIM。成功建立大鼠PD異動癥模型后，持續給予生理鹽水或nAChR激動劑治療21 d。在第1天和第21天進行6次AIM評分，給藥20 min后，持續觀察1 min進行評分，間隔20 min 1次。AIM評分為4種評分之和。AIM最高評分72分(評分6次，單次最高評分為12分)。

1.6實驗分組 隨機將造模成功的PD大鼠分為3組：(1)control組(n=20)：手術毀損大鼠MFB，予以等量生理鹽水35 d；(2)L-dopa對照組(n=20)：建立PD模型后給予L-dopa和芐絲肼連續14 d，然后在給予L-dopa和芐絲肼治療前10 min給予生理鹽水，連續21 d；(3)nAChR激動劑組(n=20)：建立PD模型后給予L-dopa和芐絲肼連續14 d，然后在L-dopa和芐絲肼治療前10 min給予nAChR激動劑連續注射21 d。

1.7觀察紋狀體神經突觸 異動癥模型大鼠在第21天予以L-dopa注射1 h后，10%水合氯醛(5 ml/kg)腹腔注射麻醉，用4%多聚甲醛行心臟灌流固定。取出大鼠腦組織后在毀損側紋狀體區切取1 mm×1 mm×1 mm組織塊放入2.5%戊二醛中浸泡。標本予以固定、包埋、鉛和鈾雙染色后制成銅網，在透射電鏡下觀察紋狀體區神經突觸后致密帶的寬度和突觸間隙。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1異動癥大鼠模型制作結果 PD大鼠經L-dopa治療后，62只(71.0%)出現 AIM，平均出現時間(1.8±1.2)d，16只(20.0%)未出現AIM或AIM評分達不到異動癥模型標準，2只(3.2%)死亡。異動癥的主要表現為毀損對側旋轉行為和刻板動作， 如對側前肢不自主上下拍打、抓撓或顫抖；嘴巴出現不自主舔舐、咀嚼；頸部和軀干向健側扭轉；快速地向對側旋轉、首尾相連；偶向健側伸舌等。治療全程中，4～7 d達到典型異動癥標準， 14～21 d達到高峰。

2.21 d nAChR激動劑治療不能改善PD大鼠異動癥 PD大鼠注射L-dopa 14 d后隨機分配到L-dopa對照組和nAChR激動劑組，L-dopa對照組AIM評分〔(32.01±3.22)分〕與nAChR激動劑組〔(29.11±2.88)分〕無統計學差異(P>0.05)。nAChR激動劑干預1 d時，L-dopa對照組AIM評分〔(29.51±3.10)分〕與nAChR激動劑組〔(28.82±2.07)分〕無統計學差異(P>0.05)。表明1 d nAChR激動劑對PD大鼠異動癥無明顯改善作用。

2.321 d nAChR激動劑可減輕PD大鼠異動癥 持續予以nAChR激動劑21 d后對PD大鼠進行AIM評分。nAChR激動劑組AIM評分〔(21.15±2.08)分〕較L-dopa對照組〔(32.01±3.22)分〕顯著降低(P<0.05)。分別比較AIM的4個部分，L-dopa對照組軸性及前肢AIM評分均顯著高于nAChR激動劑組(P<0.05)，而兩組口面部及對側旋轉運動AIM評分無統計學差異(P>0.05)。見表1。

2.4紋狀體區神經突觸的超微結構 L-dopa對照組與control組比較，突觸后膜致密帶寬度顯著增大,突觸間隙寬度顯著變窄(P<0.05)。nAChR激動劑組與L-dopa對照組相比，突觸后致密帶寬度顯著減小,突觸間隙的寬度顯著變大(P<0.05)，見表1。

表1 各組軸性AIM、前肢AIM、口面部AIM、對側旋轉運動AIM評分、紋狀體突觸寬度及致密帶寬度

3 討 論

L-dopa治療PD 5年后有40%～90%患者出現異動癥，嚴重降低PD患者生活質量甚至致殘。治療異動癥的藥物包括作用于多種神經遞質多巴胺能、谷氨酸能、5-羥色胺能、γ-氨基丁酸(GABA)能、腺苷受體、腎上腺神經的藥物，還有nAChR激動劑、馬福利特、咖啡因等〔11～14〕。本研究PD大鼠異動癥隨治療時間延長程度逐漸加重，這可能和波動性L-dopa治療和黑質紋狀體多巴胺能神經元變性壞死增多有關。實驗證明無論是間歇性nAChR激動劑治療還是持續nAChR激動劑治療,都可能有助于治療PD患者L-dopa所致的運動障礙〔15〕。nAChR亞型中有α4β2，α6β2 和α7 nAChR在紋狀體中表達。Johnston等〔16〕發現長期服用nAChR激動劑的L-dopa大鼠,無論是間歇注射還是通過滲透泵給藥,nAChR激動劑對改善已建立的口舌部和前肢的表達有類似作用。Iderberg等〔11,12,17〕發現nAChR激動劑可減輕PD猴子模型和嚙齒類動物模型的異動癥癥狀，表明nAChR激動劑在多種物種中均有效。有以下可能的作用機制：①通過 nAChR作用影響多巴胺能神經元的活性，促進多巴胺釋放，減輕黑質紋狀體區神經元的損害 。②nAChR激動劑可激活黑質多巴胺神經元α7 nAChRs，刺激抗炎的信號通路參與調節細胞因子產生，如腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ 和白細胞介素(IL)-6〔18〕，從而減輕神經系統炎癥；通過nAChR降低多巴胺能神經元中不穩定鐵元素的含量發揮神經保護作用〔19〕。異動癥是L-dopa治療PD后神經細胞產生被動適應和可塑變化的結果 。本研究結果示持續21 d nAChR激動劑治療可明顯減輕神經突觸超微結構的變化。可能緣于該藥治療干擾正常多巴胺運動神經元生理調控機制。神經元的可塑性表現在功能上的改變如神經遞質釋放的增加 ，受體敏感性的增強；表現在解剖上的改變比如軸突的再生長，出現萌芽和新生突觸〔20〕。