美國白蠟扦插過程中插穗內含物變化分析

常雪薇 ，薛滿滿，李春明，楊立學*

(1.東北林業大學 林學院，哈爾濱 150040；2.森林生態系統可持續經營教育部重點實驗室(東北林業大學)，哈爾濱 150040; 3.黑龍江省林業科學研究所，哈爾濱 150080)

0 引言

美國白蠟(Fraxinusamericana)為木犀科(Oleaceae)白蠟屬(Fraxinus)落葉喬木，原產于加拿大南部和美國，最早于20世紀60年代引入我國，在華北地區廣泛分布[1-3]。美國白蠟具有耐旱、耐寒、耐澇和耐鹽堿等優良特性，是鹽堿地造林、公路綠化、城市街道綠化的重要樹種[4]。其種子繁殖成活率較高，但是由于美國白蠟的幼齡期長，具有明顯的結實間隔性，且種子具有深度休眠的特性，進行播種時要先打破休眠[5]。在無性繁殖中，扦插繁殖具有操作簡單、成本較低、材料充足和繁殖速度快等優點，在遺傳方面可以保持母樹優良的品質，有利于優良個體的擴繁[6]。目前對美國白蠟扦插繁殖報道較少，且主要對扦插技術方面進行了研究，其扦插生根過程中的一系列生理變化及生根類型尚不明確。本試驗通過對美國白蠟扦插過程中的內源激素含量和酶活性進行分析，為美國白蠟的生根機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

試驗于2020年8月在黑龍江省牡丹江市陽明區茂森苗木種植專業合作社溫室中進行(44°6′N，129°63′E)，該地處于中溫帶大陸性季風氣候區，年均降水量約540 mm，年均氣溫4.3 ℃。試驗期間棚內溫度保持在20～30 ℃，空氣相對濕度維持在90%以上。

1.2 試驗材料的選取及處理

從苗圃選擇生長健壯的2年生優良母株，選取無病蟲害、粗細大致相同的當年生枝條剪成長5～8 cm的插穗，每枝插穗留2～3個芽，1片葉，上端平剪，下端45°左右斜剪，切口距芽約1 cm，上切口用封口膠密封。選用草炭土與蛭石的體積為1∶3作為基質，插穗采用北京博奧拓達科技有限公司生產的外源激素萘乙酸(NAA)(150 mg/L)處理6 h，清水處理為對照，重復3次，每次重復100根。

分別在插后0、6、12、18、24、30 d取樣，共取6次，每次重復選取5根插穗用清水沖洗干凈，對插穗生根狀況拍照記錄后取基部2 cm左右韌皮部剪碎稱重后裝入凍存管，迅速放入液氮罐中保存，待取樣完成后干冰冷凍下寄回實驗室保存。

1.3 測定指標及方法

內源激素的測定：采用酶聯免疫法(ELISA)，稱取0.3 g樣品加液氮研磨成粉末狀，對插穗內生長素(IAA)、脫落酸(ABA)、玉米素核苷(ZR)和赤霉素(GA3)含量進行測定。

酶活性測定：多酚氧化酶(PPO)、吲哚乙酸氧化酶(IAAO)和過氧化物酶(POD)酶活性選用蘇州科銘生物技術有限公司的試劑盒，按照說明書的步驟進行測定。

用Microsoft Excel 2010對數據進行統計分析并做表，用SigmaPlot12.5進行作圖。

2 結果與分析

2.1 美國白蠟生根過程中形態學研究

經觀測，美國白蠟主要為皮部生根型，少量為混合生根型。扦插前6 d，插穗葉片鮮活無明顯變化，插穗基部皮孔變大；第12 天觀察到插穗下切口開始膨大，插穗的皮下有白色愈傷組織生成，且部分插穗皮部凸起，形成白色顆粒；第18天觀察發現插穗從皮部開始生成不定根，少量在愈傷組織部位處生根；第24天，插穗不定根大量產生并開始伸長，且開始出現側根。扦插后第30天，插穗不定根持續伸長，且側根逐漸增多變粗，插穗生根數和形態基本保持穩定。故其生根進程可大致分為3個時期：0～12 d為生根誘導期(愈傷組織形成)，12～24 d為不定根表達期(不定根出現)，24 d后為不定根伸長發育期，如圖1所示。

圖1 美國白蠟扦插生根過程中段插穗形態

2.2 美國白蠟生根過程中內源激素含量及比值變化

2.2.1 IAA含量變化

美國白蠟生根過程中，NAA處理組與CK對照組內源激素IAA含量變化趨勢大致相同，均呈上升—下降趨勢。扦插0～6 d，處理組和對照組插穗內源激素IAA含量均上升，并在第6天到達峰值，此時處理組比對照組的同期值高14.08%。扦插12～18 d，處理組IAA含量小幅度地升高。扦插18～30 d，隨著不定根的表達和伸長，IAA含量又開始降低。CK對照組插穗6 d后內源激素IAA含量下降，在12～24 d趨于平緩。插穗生根誘導期處理組IAA含量大于對照組，說明外源施加NAA可以增加插穗內源激素IAA含量。如圖2所示。

圖2 美國白蠟扦插生根過程中IAA含量變化

2.2.2 ABA含量變化

處理組插穗基部ABA含量呈上升—下降—上升—下降趨勢，對照組呈上升—下降—上升趨勢。扦插0～6 d，處理組和對照組的ABA含量均顯著升高。6～12 d，處理組和對照組ABA含量開始下降，此時愈傷組織形成、根原基出現。12～24 d，隨著不定根的出現和伸長，處理組ABA含量開始迅速上升，并于第24天達到峰值，為67.71 ng/g，同期值比對照組高出83.70%，此時根源基開始發育、不定根逐漸形成，而對照組缺少激素刺激發育較慢，ABA含量仍呈下降趨勢。24 d之后插穗進入到不定根伸長期，處理組ABA含量又開始降低，此時對照組ABA含量開始升高，比處理組落后12 d如圖3所示。

圖3 美國白蠟扦插生根過程中ABA含量變化

2.2.3 GA3含量變化

處理組GA3含量變化趨勢呈上升—下降、對照組呈上升—下降—上升—下降。扦插后0～6 d，2組GA3含量均呈上升趨勢，6～12 d開始逐漸降低，12～24 d處理組含量持續降低，對照組含量呈升高趨勢，且在第24天達到峰值，為9.72 ng/g，比處理組同期值高19.08%。24 d之后插穗進入不定根伸長發育期，處理組GA3含量開始小幅度升高，對照組GA3含量開始下降，在第30天逐漸和處理組的值趨于一致。如圖4所示。

圖4 美國白蠟扦插生根過程中GA3含量變化

2.2.4 ZR含量變化

NAA處理組和對照組插穗的ZR含量變化趨勢基本一致，均為下降—上升，如圖5所示。處理組前6 d ZR含量下降，而后ZR含量一直升高，且前期上升較慢，后期上升較快；對照組扦插后ZR含量降低，且谷值低于處理組，比處理組降低8.85%，6～12 d迅速升高，24 d之后對照組有下降的趨勢。0～12 d，插穗的ZR含量先下降后上升，插穗剛脫離母體ZR含量降低，隨后進入插穗生根誘導期，且有愈傷組本織的生成，ZR含量升高。12～18 d，插穗開始產生不定根，此時ZR含量一直升高，18～24 d 內源激素ZR含量上升較快。24 d后，處理組ZR含量緩慢上升，對照組下降。

圖5 美國白蠟扦插生根過程中ZR含量變化

2.2.5 IAA/ABA值的變化

本研究中發現：處理組IAA/ABA值變化明顯，扦插0～12 d處理組的IAA/ABA值下降之后又有所升高，并保持在較高值，此時為生根誘導階段，說明根原基的誘導需要較高的IAA/ABA值。12～24 d，處理組比值開始降低，此時為不定根表達期，在此階段ABA含量不斷增加，而IAA被消耗，IAA/ABA值下降，于24 d達到谷值0.54，比對照組的同期值低44.33%，這與對照組在12 d之后的變化趨勢相反。24 d后，隨著插穗不定根的伸長，處理組的IAA/ABA值又開始升高。對照組插穗IAA/ABA值變化平緩，0～12 d比值呈下降趨勢，之后12～30 d緩慢升高，且比值一直大于處理組。如圖6所示。

圖6 美國白蠟扦插生根過程中IAA/ABA值變化

2.2.6 IAA/ZR值的變化

在插穗生根進程中，處理組IAA/ZR值呈上升—下降趨勢，對照組IAA/ZR值呈上升—下降—上升的趨勢。扦插前 6 d，處理組和對照組的IAA/ZR值均升高，并在第6 天達到峰值，處理組比對照組的同期值高4.51%。6～12 d，2組的IAA/ZR值降低，但仍大于初始值。12～18 d，處理組和對照組IAA/ZR值都處于一個相對穩定的狀態，且2組都保持在較高水平，說明高比值的IAA/ZR有助于插穗不定根的表達。18～24 d，2組比值均呈下降趨勢，處理組下降速度較快。24 d后處理組IAA/ZR值持續下降，對照組升高。說明高比值的IAA/ZR有助于插穗不定根的表達，如圖7所示。

圖7 美國白蠟扦插生根過程中IAA/ZR值變化

該試驗觀察并分析美國白蠟在生根進程中30 d的變化，分別在插后0、6、12、18、24、30 d取樣，得出外源激素NAA處理對美國白蠟生根進程中插穗內源激素含量及其比值的特征值影響，見表1。

表1 NAA處理對生根進程中插穗內源激素含量及其比值的特征值影響

2.3 美國白蠟生根過程中相關酶活性的變化

2.3.1 POD活性的變化

處理組和對照組POD活性變化趨勢基本一致，均呈現上升—下降—上升的變化趨勢。0～12 d，處理組和對照組POD活性升高，在第12天達到最高水平，處理組比對照組峰值低5.57%。之后POD活性開始降低，在扦插24 d之后，又開始升高，24 d之后插穗進入不定根伸長期，POD活性升高，如圖8(a)所示。

2.3.2 PPO活性的變化

NAA處理組和對照組PPO活性變化趨勢大致相同，都呈上升—下降趨勢，但出現峰值的時間不同。扦插前期，對照組和處理組酶活性均增加。處理組在12 d達到峰值比對照組同期值高96.97%，既在愈傷組織形成期和不定根發生過渡期PPO活性達到最高。扦插后12～24 d，處理組PPO活性逐漸降低，并在第24天達到最小值。24 d后插穗體內PPO活性逐漸回升。如圖8(b)所示。

圖8 美國白蠟插穗生根過程中氧化酶活性變化

2.3.3 IAAO活性的變化

NAA處理組的IAAO活性變化趨勢呈上升—下降—上升，對照組呈升高—下降—升高—下降。扦插初期，處理組和對照組IAAO活性均升高，NAA處理組峰值比對照組高16.16%；扦插6～18 d，處理組IAAO活性降低，且在第18天降低至最小值；扦插18～30 d，NAA處理組的IAAO活性開始升高，IAAO活性的升高導致同期IAA含量的下降。對照組插穗在扦插12 d之后IAAO活性就開始升高，比處理組提前6 d；對照組在24 d之后IAAO活性開始降低，與處理組趨勢相反，如圖8(c)所示。

通過對美國白蠟生根過程0～30 d 的觀察，得到外源激素NAA處理對生根進程中插穗氧化酶活性的特征值的影響，見表2。

表2 NAA處理對生根進程中插穗氧化酶活性的特征值影響

2.4 各生理指標間相關性分析

由表3相關性分析結果表明，在生根過程中IAA含量與ABA、GA3含量和PPO酶活性之間呈極顯著正相關關系(P<0.01)；ABA與GA3含量及PPO活性之間呈顯著正相關關系(P<0.05)；GA3含量與PPO活性之間呈極顯著正相關關系(P<0.01)，與IAAO活性呈顯著正相關關系(P<0.05)；POD與PPO活性之間呈極顯著正相關關系(P<0.01)。

表3 插穗不同生長階段生理指標相關性分析

3 結論與討論

3.1 結論

美國白蠟插穗生根過程根據其外部形態變化可分為3個階段：0～12 d為生根誘導階段；12～24 d為不定根表達階段；24 d后為不定根伸長階段。較高含量的IAA和ZR有利于插穗根原基的產生。較低含量的IAA、ABA和較高含量的GA3、ZR有利于插穗不定根的伸長。較高的IAA/ABA和IAA/ZR值有利于根原基的發生，不定根的發生和伸長需要較低的IAA/ZR值。外源激素的使用在一定程度上影響著酶活性的變化。高活性的POD和PPO有助于根源基的形成和不定根的分化，低活性的IAAO有助于根原基的形成和不定根的表達，高活性的IAAO有利于不定根的伸長。

3.2 討論

生長素的動態變化是研究植物扦插內源激素的重點，普遍認為IAA能夠有效促進不定根的發生和伸長。在扦插過程中，插穗不定根的生成受到多種因素影響，其中生長素對插穗生根具有明顯的促進作用[7-8]。本研究發現，IAA對插穗生根具有直接影響，生根誘導和不定根表達都需要較高水平的IAA，這與史鋒厚等[9]對南京椴(TiliamiquelianaMaxim.)的研究結果一致；在不定根表達期，處理組的IAAO活性降低到谷值，使得被IAAO氧化分解的IAA減少，因此處理組IAA含量上升并達到峰值，這與胡國宇等[10]對費約果(Feijoasellowiana)扦插的研究結果一致。

ABA通常被認為是生根抑制劑，插穗內ABA含量越高，插穗生根越困難[11]，其主要生理功能為抑制細胞分裂，促進葉片脫落。一般認為ABA對逆境激素的調節作用明顯，所以研究插穗體內的ABA含量的變化有著重要的意義。ABA在逆境條件下可以引起植物氣孔關閉，提高植物抗逆性，本研究中扦插初期插穗ABA含量升高，可增強離體插穗對逆境的適應性，降低逆境對切口損傷的影響，并對根原基的產生做準備，這與朱晗等[12]對沙生檉柳(Tamarixtaklamakanensis)的研究結果一致。之后在不定根發生階段ABA含量持續增加，在不定根伸長階段ABA含量又開始降低，這與楊宏偉等[13]對黑枸杞(Lyciumruthenicum)的研究結果一致。多數情況下植物生長發育過程受多種激素的調節，植物不定根的形成也是多種植物激素共同影響的結果，因此在激素含量變化中研究兩兩比值可以更全面地評述多種激素對扦插不定根發育的影響[14]。ABA與IAA含量呈極顯著正相關關系，ABA通過與IAA 的平衡來調控插穗的生根，較高的IAA/ABA值可促進插穗生根[17]。外源激素的使用雖然沒有使插穗體內ABA含量降低，但是卻調節了IAA/ABA的比值，對插穗體內內源激素的動態平衡起到了調控作用，進而促進插穗生根；在不定根伸長期，較低的IAA/ABA值有利于美國白蠟不定根的伸長發育。

GA3是細胞分裂的促進物質，能促進植株莖的伸長，普遍認為高含量的GA3阻礙根原基形成[15-16]。在本次研究中，GA3含量在扦插初期有所升高，處理組含量在根原基誘導和不定根伸長發育階段持續降低，低含量的GA3有助于根源基的產生與不定根的伸長，這與韓繼紅等[17]的研究結果一致。在不定根表達期，處理組的GA3含量降低，對照組的GA3含量升高，這可能是由于外源激素的使用抑制了GA3的產生，導致處理組和對照組變化趨勢相反。IAA與ABA、GA3含量之間呈極顯著正相關關系，三者之間相互影響共同調控美國白蠟的生根過程。

ZR是一種主要的天然游離型細胞分裂素，有研究認為ZR抑制不定根的形成[18]。ZR含量先降低后持續升高，外源激素的使用降低了不定根形成期插穗的ZR含量，說明根源基誘導不定根形成要求低含量的ZR。IAA/ZR值在愈傷組織形成初期升高，NAA處理提高了插穗的IAA/ZR值，且較高的IAA/ZR值有助于根原基的生成，這與胡國宇等[10]對費約果的研究結果一致。不定根表達前期，處理組和對照組IAA/ZR值都處于一個相對穩定的狀態，且2組都保持在較高水平，說明當IAA/ZR值較高且相對穩定時有利于根源基的發育。不定根表達后期由于不定根大量生出且開始伸長，消耗大量 IAA，同時插穗自身可能合成內源ZR，ZR相對含量升高，使得IAA/ZR值逐漸下降，較低的IAA/ZR值有利于不定根的伸長。

在插穗生長和生根過程中，酶具有重要作用。目前對酶活性的研究主要集中在IAAO、POD、PPO與扦插生根的關系[19-20]。POD是一種活性較高的酶[21]，其活性在許多植物的扦插中被用于界定生根階段(根源基誘導期、不定根表達期)。本研究扦插前期POD活性增高，此時為愈傷組織形成和不定根出現的過渡時期，說明POD酶活性的增高可促進美國白蠟愈傷組織的形成和不定根的分化。在伸長期之前，2組的POD活性呈單峰變化趨勢，在不定根伸長期POD活性有所回升，在整個生根過程中處理組與對照組之間的POD活性差異不顯著，說明NAA的使用對美國白蠟插穗韌皮部的POD活性影響不大。

通過油橄欖(Oleaeuropaea)[22]扦插發現，生根率較低的插穗PPO活性較低，而生根率較高插穗PPO活性較高，韃靼忍冬(Loniceratatarica)[23]的扦插中PPO活性峰值大多出現在不定根表達、生根和伸長階段，高PPO活性有利于插穗生根。本研究結果表明PPO活性在根源基發育期達最高水平，說明較高的PPO活性有利于根原基的誘導與根系的發育。PPO活性與IAA含量呈極顯著正相關關系，可能是由于PPO可以催化酚類物質與IAA合成“IAA-酚酸復合物”，通過調節IAA的代謝，促進愈傷組織和不定根的產生[24]。在不定根表達期酚類物質分解，插穗不再需要大量的PPO，因此PPO活性降低。隨著處理組根系進入伸長期，插穗發育成完整的個體，PPO活性增加。NAA的使用提高了處理組PPO活性，這與黃梅等[25]的研究結果一致。PPO與POD活性呈極顯著正相關關系，生根過程中兩者的變化趨勢相似，而在對美國薄荷(Monardadidyma)[26]的研究中，PPO與POD活性呈負相關關系，這2種酶之間的相互作用還需進一步研究。

IAAO是植物體內廣泛存在的一種酶，可以通過對插穗內的IAA含量調控來實現對插穗生長的影響。本研究中，在不定根表達期插穗體內IAAO活性降至最低，從而使IAA含量升高促進生根，這與鄭巧巧等[27]的試驗結果一致。美國白蠟插穗生根與IAAO、POD、PPO活性緊密聯系，但在不同的生長階段IAAO、POD、PPO活性之間是否存在聯系尚不明確。

本研究記錄了美國白蠟插穗的生根過程和生根類型，劃分了生根階段，對生根過程中4種內源激素含量與3種氧化酶活性進行了研究，對美國白蠟的生根機理進行了初步探究。但林木扦插生根是一個復雜的過程，美國白蠟生根過程中的礦質養分(鋅、錳和鐵等)含量以及酚類化合物含量對插穗生根的影響有待進一步研究。