陜西6個主栽核桃品種花粉特性研究

張煥玲，童開林，梁烜毓

(1.西北農林科技大學 林學院，陜西 楊凌 712100；2.楊凌職業技術學院，陜西 楊凌 712100)

0 引言

品種混雜、良種化程度低是當前核桃栽培中普遍存在的問題[3-5]，極大地限制了核桃產業的健康發展。雜交育種是核桃良種選育的主要途徑，核桃屬雌雄同株異花樹種，雌雄花期不嚴格一致，花粉活力及貯藏特性是核桃雜交育種能否取得成效的關鍵。花朵是植物的繁殖器官，具有穩定的遺傳特性，花粉形態是品種鑒定的重要指標，同時也是影響雜交育種中授粉方式與方法的重要因素[6]。因此，開展核桃花粉活力、貯藏特性及形態特征研究，可為核桃雜交育種及品種鑒定提供依據，促進核桃產業健康發展。

關于植物花粉活力測定的文獻報道已經很多，但胡桃屬樹種花粉研究多集中在山核桃方面，核桃花粉活力的研究相對較少。胡青等[7]用TTC染色法測定了‘漾濞大泡’與‘云新高原’核桃花粉活力；肖真真等[8]比較了3種染色劑對‘新新2號’核桃花粉活力的測定效果，各種染色劑在不同品種中的表現不盡相同。核桃花粉貯藏條件的研究報道更少，劉杜玲等[9]對5個核桃品種貯藏溫度進行了研究，發現3 ℃和-20 ℃條件有利于核桃花粉活力保持，但不同核桃品種最適貯藏溫度不同；杜晉城等[10]則發現5 ℃比-20 ℃和-70 ℃條件更利于核桃花粉貯藏，且-70℃條件下核桃花粉活力只能保持不到1 d。核桃花粉形態研究早期多借助光學顯微鏡，后期采用掃描電鏡技術，主要涉及新疆主栽核桃品種[11]、胡桃科不同屬樹種[12]、薄殼山核桃品種[13]，均發現不同樹種/品種在花粉粒大小、表明飾紋和萌發孔等方面存在不同程度差異。未見關于陜西主栽核桃品種花粉形態的研究報道。

本研究以陜西主栽的6個核桃品種花粉為研究對象，在研究篩選花粉活力測定方法的基礎上，開展了6個核桃品種花粉生活力、貯藏特性及掃描電鏡形態研究，以期為核桃雜交育種、栽培和品種鑒定等提供基礎數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為6個陜西主栽核桃品種的花粉，即‘清香’‘香玲’‘西扶1’‘西洛3’‘中林5’‘陜核’，采自西北農林科技大學周至縣渭河試驗站核桃種質資源收集圃。

1.2 方法

1.2.1 花粉收集

采集各品種盛花期散粉中期的雄花序，帶回實驗室平鋪于硫酸紙上，室溫(20 ℃)下放置至花藥全部開裂散粉，花粉經自然干燥至含水率約為20%時，收集于玻璃指形管內(瓶口用脫脂棉塞)，將指形管置于室溫避光處室溫貯藏，或置于干燥器內冰箱低溫貯藏。

看似凌亂的筆墨，點點是辛酸淚，滿紙墨葡萄，一腔哀怨無人傾聽。透過這一顆顆晶瑩透徹的葡萄似乎可以看到五百多年前徐渭滿腹憂愁，空有一身才華無人問津而獨自哀怨。懷才不遇的悲憤、明珠暗投的無奈像一把利刃殘酷地將徐渭扼殺在渡往夢想彼岸的扁舟上，滿腔義憤化成顆顆明珠閑擲野藤之中。就這樣，“幾間東倒西歪屋，一個南腔北調人”悄悄地走進了塵封的煙塵……

1.2.2 花粉活力測定方法比較

以剛收集的6種花粉為試材，比較不同染色劑對核桃花粉活力的測定效果，為花粉貯藏實驗中活力測定選擇簡捷方便的測定方法，以培養基法做對照。

染色液選用3種：1%TTC(氯化三苯基四氮唑)、0.5%MTT(噻唑藍)和I2-IK(碘-碘化鉀)，參考肖真真等[8]的研究方法，培養基法參考朱雪晨等[14]的研究方法。

花粉活力計算：①染色法花粉活力=(染色花粉粒數/總花粉粒數)×100%。②培養基法花粉活力=(萌發花粉粒數/總花粉粒數)×100%，花粉管長度超過花粉粒直徑的一半視為萌發。每種方法重復3次，顯微鏡(奧林巴斯 CX23)10 倍鏡下統計3個視野。

1.2.3 花粉貯藏特性研究

將收集的6種干燥花粉分別置于室溫(20 ℃)、4 ℃和-20 ℃冰箱內保存。從保存之日起，每隔1 d測定不同貯藏溫度下的花粉活力，直至活力喪失。花粉活力測定使用1.2.2中篩選的染色法。

1.2.4 花粉電鏡掃描

用掃描電子顯微鏡(SEM,日立S-4800)觀察花粉粒形態特征。將收集的新鮮花粉在無水乙醇中浸泡脫水1～2 h，待其自然干燥24 h后，將花粉均勻撒于粘有雙面導電膠的樣品托上，真空噴金鍍膜，置于電鏡下掃描拍照。每個品種隨機選取10枚花粉在1 800～10 000 倍鏡下拍照。用Photoshop CS 6.0測量花粉粒的極軸、赤道軸，萌發孔的長軸和短軸及其比值，并根據王開發等[15]的分類標準劃分花粉形狀類型。將10個花粉粒單側萌發孔數量平均數乘以2，即為該品種花粉粒的萌發孔數量。

1.2.5 數據統計分析

所有數據用SPSS 20.0軟件中的one-way ANOVA進行LSD檢驗，其中花粉活力數據經反正弦轉換、萌發孔數量經倒數轉換后進行分析。

2 結果與分析

2.1 核桃花粉活力測定方法比較

不同方法測定6種核桃花粉活力結果見表1。結果表明，6種核桃花粉經MTT染色后均有染成深紅色的花粉和未染色的花粉，且能明顯識別，如圖1(a)所示，這與MTT在玉蘭[16]、‘新新2號’核桃[8]中的報道結果類似。相反地，TTC染色法只能識別‘香玲’有活力和失活的花粉，I2-IK染色法只能識別‘西扶1’和‘陜核’有活力和失活的花粉，其他品種的花粉均被TTC染成了紅色，如圖1(b)所示，被I2-IK染成了深藍色，如圖1(c)所示，無法識別有活力和失活的花粉。這與段青等[17]在大麗花、郝家臣[18]、王非等[19]在核桃楸、肖真真等[8]在‘新新2號’核桃中的研究結果類似，但與胡青等[7]在‘漾濞大泡’與‘云新高原’核桃中的研究結果不一致。

(a)MTT (b)TTC (c)I2-IK

表1 核桃花粉活力不同測定方法比較

6個核桃品種MTT染色所測定的花粉活力均比在同一種培養基中測定的活力高，高出范圍在1.33%～11.86%，平均高出約4.6個百分點。花粉活力染色法測定結果高于培養基法測定結果的現象在通關藤[20]和山茶屬[21]研究中也有發現。雖然MTT染色法與培養基法在同一核桃品種中測定結果不一致，但2種測定結果除在‘香玲’和‘西扶1’中顯著差異外(P<0.05)，在其他4個品種內均無顯著性差異(P>0.05)，而且2種方法測定的6個核桃品種花粉活力大小變化趨勢是一致的，花粉活力由大到小均依次為：‘中林5’‘香玲’‘西洛3’‘陜核’‘清香’‘西扶1’。

以上結果說明MTT在核桃花粉活力測定中具有較強的廣譜性，測定結果可以用來衡量品種間花粉活力的大小。

2.2 6個核桃品種的花粉貯藏特性

研究了6種核桃花粉在3個溫度條件貯藏不同時間的活力變化情況，如圖2所示，由圖2可知，6個核桃品種花粉初始活力差別大，‘中林5’和‘香玲’活力相當，且顯著高于其他品種(P<0.05)，分別為37.31%和35.56%；‘西洛3’活力次之，為24.79%；‘陜核’‘清香’‘西扶1’活力較低，無明顯差異(P>0.05)，分別為19.26%、17.71%和16.99%。

每個溫度下的柱狀圖從左到右依次代表貯藏0,1,2,…,n d的花粉活力。

3種溫度下6種核桃花粉活力均呈現隨貯藏時間延長而快速降低的趨勢。室溫(20 ℃)下貯藏的核桃花粉壽命很短，只存活4～5 d，‘香玲’‘西洛3’‘陜核’‘中林5’在貯藏4 d后花粉活力為0，‘清香’‘西扶1’在貯藏5 d后花粉活力為0。

4 ℃條件下，除西扶1外，其他5種花粉壽命都有所延長，‘香玲’‘清香’‘西洛3’‘陜核’‘中林5’分別延長至9、8、10、11、13 d，比室溫(20 ℃)下壽命延長了5～9 d。‘西扶1’花粉在4 ℃和溫室(20 ℃)下的壽命一樣，但花粉活力在前4 d的降低速率要比室溫(20 ℃)下慢很多。4 ℃下清香花粉壽命得以延長，但在前4 d的活力下降要比室溫(20 ℃)快，其他品種的花粉在整個貯藏期活力降低速率明顯低于室溫(20 ℃)。

-20 ℃條件不利核桃花粉貯藏，除‘清香’和‘西洛3’與室溫(20 ℃)下的壽命一樣，其他4種花粉的壽命都比室溫(20 ℃)下短，只有2 d時間。貯藏期間6個核桃品種花粉在4 ℃下的活力明顯高于-20 ℃條件。

2.3 6個核桃花粉形態特征

掃描電鏡觀察核桃花粉的外部形態特征如圖3所示，發現供試的6個核桃品種花粉粒均為單粒，外形相似，極軸與赤道軸比例在1.03～1.1，見表2，形狀均為近球形。花粉粒表面均密集均勻分布有顆粒狀突起，‘清香’‘香玲’‘西扶1’‘中林5’和‘陜核’5個品種在顆粒狀突起與突起之間隆起形成脊，脊與脊相互連接形成網狀紋飾，‘西洛3’顆粒狀突起無脊連接，如圖4所示。

圖3 6個核桃品種花粉粒電鏡掃描形態

箭頭所指為連接2個突起之間隆起的脊。

6個核桃品種花粉粒表明均具13～20個數目不等的圓形萌發孔，萌發孔內部凹陷，外周突起(‘清香’‘西洛3’‘中林5’和‘陜核’突起明顯)，其上未發現膜結構。萌發孔數量品種間差異顯著(P<0.05)，最多的是‘中林5’和‘陜核’，平均為18個和18.3個，‘清香’和‘西扶1’萌發孔數量居中，平均為15.7個和14.7個，‘香玲’和‘西洛3’萌發孔數量最少，平均為13.7個和13個。不同品種萌發孔長軸與短軸無顯著差異(P>0.05)，長軸在3.26～3.75 μm，短軸在2.75～3.35 μm，長短軸比例在1.06～1.21。萌發孔長軸最長的品種是‘清香’，為3.75 μm，最短的品種是‘西扶1’；短軸最長的品種是‘西洛3’，最短的是‘陜核’，見表2。

表2 6個核桃品種花粉粒萌發孔形態特征比較

6個核桃品種花粉粒大小存在顯著差異(P<0.05)，見表3，極軸長度在39.19～44.35 μm，赤道軸長度在35.58～42.86 μm。‘清香’‘陜核’花粉粒極軸較長，分別為44.01 μm和44.35 μm，顯著長于其他4個品種。‘西扶1’花粉粒極軸居中，為41.43 μm，‘香玲’‘中林5’‘西洛3’極軸長較小，分別為39.78、39.19、39.54 μm。‘清香’‘陜核’和‘西扶1’花粉的赤道軸顯著長于其他3個品種(P<0.05)，分別為42.86、41.63、40.53 μm，‘西洛3’赤道軸最短，為35.58 μm。綜合極軸和赤道軸長度數據可知，‘清香’‘陜核’，花粉粒相對較大，‘西扶1’居中，‘香玲’‘西洛3’和‘中林5’花粉粒相對較小，但都屬于中等大小的花粉粒[15]。

表3 6個核桃品種花粉粒大小比較

3 討論與結論

3.1 討論

花粉活力測定主要有培養基法、染色法和電導率法3種方法。電導率法因受環境影響大，可靠性難以保證，近年來很少采用。培養基法是用花粉萌發力來間接測定花粉活力的一種方法，結果較可靠，但操作麻煩，不同樹種花粉萌發需要不同培養基成分[6]。染色法因簡單快速，近年來被大多研究者采用。已報道使用較多的染色劑有TTC、I2-IK、MTT和醋酸洋紅，但不同染色劑對不同樹種花粉染色效果差異較大[7-8,10-11,14-19]。如用TTC可有效測定‘漾濞大泡’與‘云新高原’核桃花粉活力[7]，但在核桃楸[18-19]、大麗花[16]和‘新新2號’核桃[8]花粉活力測定中效果較差。I2-IK在葛根[22]、通關藤[20]花粉活力測定中染色效果較好，但在大麗花[16]、核桃楸[18-19]、‘新新2號’核桃[8]中效果不佳。本研究發現TTC和I2-IK均不適合6個核桃品種花粉活力測定，但MTT能很好區別6個核桃品種有活力與失活的花粉，MTT也適合于‘新新2號’核桃[8]和玉蘭[16]花粉活力測定。這說明染色劑在花粉活力測定中具有極強的選擇性，在利用染色法測定核桃花粉活力時，TTC和I2-IK對品種的選擇性更強，不具有廣譜性，而MTT對品種的選擇性較小，可以用來測定更多核桃品種的花粉活力。

花粉壽命是影響雜交育種成效的關鍵因素之一[6]，研究表明，在20%含水率、黑暗條件下，6個核桃品種花粉壽命均較短，溫室(20 ℃)條件下只有4～5 d，且活力下降明顯，因此在核桃雜交育種中盡量使用新鮮花粉進行控制授粉，不要使用散粉2 d后的花粉。6個品種的花粉初始活力都較低，最高只有37.31%，因此在雜交育種中進行控制授粉時要采用增加花粉量和重復授粉次數措施，以確保提高受精率。本研究發現4 ℃有利于核桃花粉貯藏，花粉活力保持期限較室溫條件(20 ℃)長，但-20 ℃條件下花粉很快會喪失活力。冷凍溫度不適合核桃花粉貯藏的結論也有報道[9-10]，這可能與核桃花粉缺乏冰凍保護物質有關，可在保存時使用甘油等冰凍保護劑措施，但保護劑是否會影響花粉活力及受精能力是值得考慮的。

花粉粒形態特征是物種鑒定的重要指標之一，劉劍鋒等[23]通過掃描電鏡觀察發現，5種秋子梨品種的花粉粒形態大小存在的差異，可以作為品種鑒別分類的依據。曹清河等[24]通過觀察甘薯近緣野生種的花粉粒大小、兩軸長短、萌發器官特點和表面紋飾類型把種類予以區分。毛霞等[12]對胡桃科6個屬的花粉進行了研究，發現花粉的外壁紋飾是最有價值的種屬分類依據。這些研究多是同屬不同種的植物，花粉粒形態差異較大。本研究涉及的6個品種是同一個種，花粉形態和表面飾紋區別不明顯，據此鑒定品種難度較大，但在花粉粒相對大小及萌發孔數量方面品種間差異顯著，可作為品種鑒定的依據。

3.2 結論

本研究對陜西省主栽的6個核桃品種花粉特性進行了研究，發現TTC、I2-IK不能區分有活力與失活花粉，因而不適用于核桃花粉活力測定；MTT對品種選擇性小，適合作為核桃花粉活力的染色劑使用，其和培養基法測定的品種間花粉活力趨勢一致。在20%含水率、黑暗條件下，6個核桃品種的花粉壽命都比較短，溫室(20 ℃)條件下壽命只有4～5 d，適溫條件下貯藏壽命也不會超過14 d。6個核桃品種花粉初始活力差異顯著，‘中林5’和‘香玲’的花粉活力顯著高于其他4個品種。4 ℃有利于核桃花粉貯藏，可有效延長6種花粉壽命5～9 d；-20 ℃并不利于核桃花粉貯藏，4個品種的花粉壽命在-20 ℃條件下只存活2 d。

6個核桃品種花粉均為近球形單粒花粉，大小差異顯著，極軸長度在39.19～44.35 μm，赤道軸長度在35.58～42.86 μm，屬中等大小的花粉粒，‘清香’和‘陜核’花粉粒相對較大，‘西扶1’居中，其他3個品種最小。6種核桃花粉粒表面均有顆粒狀突起，大多突起由隆起的脊相連，形成網狀飾紋。花粉粒表面的圓形萌發孔數目在品種間差異顯著，有13～20個不等，短軸在2.75～3.35 μm，長軸在3.26～3.75 μm。