蒙古櫟爛皮病病原菌鑒定

黃麒，陳潔，劉忠玄，劉雪峰，刁桂萍

(東北林業(yè)大學 林學院，哈爾濱 150040)

0 引言

蒙古櫟(Quercusmongolica)又名柞樹、柞木、蒙古柞和橡樹等，是殼斗科櫟屬的落葉喬木。蒙古櫟是東亞-東西伯利亞分布類型，主要分布于我國東北三省、內蒙古和河北省北部[1]，以及俄羅斯的遠東、西伯利亞、蒙古東部、朝鮮半島和日本[2]，既是東北溫帶地區(qū)的地帶性森林植被闊葉紅松林的重要組成樹種，也是華北地區(qū)暖溫帶落葉闊葉林的建群種[3-5]，是我國東北地區(qū)天然次生林的主要組成部分及我國主要用材林樹種之一。蒙古櫟適宜涼爽氣候，喜中性至酸性土壤，抗旱耐瘠薄，根系發(fā)達具有強烈的萌芽力[6]，在天然次生林內，能形成大面積純萌芽林。由于蒙古櫟的抗旱性和萌芽力，在干旱的生境下,亦能形成灌叢狀的“蒙古櫟矮林”，但在肥沃的土壤上常被其他樹種所排擠。蒙古櫟對氣候、土壤條件的適應范圍較廣，耐瘠薄的土壤，不耐水濕，喜光不耐陰，除幼齡稍能耐庇蔭外，一般不能忍受來自上層林冠的庇蔭，與其他樹種相比，蒙古櫟能有效地利用強光輻射，而對弱光輻射利用效率較低。具有抗旱形態(tài)的葉、較低的水能值及浮動調節(jié)能力，在干旱期間能維持較高的光合速率[7-9]。此外，在全球變暖的背景下，蒙古櫟的地理分布有擴大的趨勢。蒙古櫟根系發(fā)達，適應性強，抗風性強，并具有良好的抗腐蝕、護坡、防腐和保土作用；其木材材料堅硬，抗腐蝕性強，可用作運輸、建筑和木材等材料，壓縮木材作機械部件，此外，蒙古櫟葉片可養(yǎng)蠶，種子可以用來釀酒，樹皮可以用來治療腹瀉[10]。

殼囊孢屬菌(Cytosporaceratosperma)是子囊菌亞門(Ascomycotina)糞殼菌綱(Sordariomycetes)間座殼目(Diaporthales)中的真菌，有性型為黑腐皮殼菌屬(Valsaceratosperma)。C.ceratosperma有許多同物異名，其形態(tài)和DNA系統(tǒng)發(fā)育存在混亂。Rossman等[11]推薦使用C.ceratosperma，優(yōu)于Valsaceratosperma。盡管在中國已報告過一些物種，但絕大多數(shù)是在培養(yǎng)過程中未被發(fā)現(xiàn)的，早期的鑒定只是基于形態(tài)學，基于其ITSrDNA基因數(shù)據(jù)系統(tǒng)發(fā)育研究進行的分類[12]。

殼囊孢屬中相當多的菌可能是相對宿主特異性的，如C.australia、C.eucalyptus、C.agarwalii，該結論還需進一步地收集數(shù)據(jù)和進行致病性研究來證實[13]。此外，目前的研究表明，作為引起枯梢病和潰瘍病的重要植物病原菌，在不同寄主中具有較高的發(fā)病率和不同的癥狀，如杏子、桉樹、白蠟、女貞、芒果、梧桐、楊樹、刺槐、柳和榆等[13-14]。Zhu等[15]的研究詳細介紹了宿主植物的范圍，包括9屬20種，即栒子屬、山楂屬、蘋果屬、李屬、梨屬、薔薇屬、鮮卑花屬、花楸屬和繡線菊屬。C.ceratosperma可以感染多種植物,包括紫葳科的藍花楹(Jacarandamimosifolia)、胡桃科的胡桃(Juglansregia)[16]，薔薇科的榅桲(Cydoniaoblonga)和一些薔薇科的經(jīng)濟作物(蘋果，沙梨)[17]。

本文介紹的蒙古櫟爛皮病，通過病害癥狀、病原菌的形態(tài)學、致病性測定及系統(tǒng)發(fā)育分析，明確該病原菌為C.ceratosperma，國內尚未有記載，為國內新病害，本研究可為該病的防治和進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

2019年7月在黑龍江省加格達奇地區(qū)(50°25′N,126°07′E)采集數(shù)枝明顯患病的蒙古櫟分枝，帶回東北林業(yè)大學森林病理實驗室分離純化，并于東北林業(yè)大學校園內采集健康蒙古櫟枝條做接種材料。植物標本和真菌分離株保存于東北林業(yè)大學病理實驗室。

1.2 癥狀觀察

對采集的蒙古櫟爛皮病病枝標本的發(fā)病癥狀進行觀察，借助手持放大鏡以及實體解剖鏡(Phenix XTL-165-MT)對發(fā)病部位進行觀察，對其危害部位和危害癥狀及其在寄主表面的排列狀況和顏色等觀察。

1.3 病原菌的分離純化

采用單孢分離法分離，獲得病原真菌。枝條表面連續(xù)在75%的乙醇(福晨化學試劑有限公司)中浸泡1 min，質量濃度2% 的NaClO溶液(福晨化學試劑有限公司)中浸泡40 s，后用無菌水沖洗3次，無菌環(huán)境下用吸水紙擦拭。從患病的枝上采集分生孢子器，在顯微鏡下用手術刀從分生孢子器中提取分生孢子，然后放在清潔工作臺的水瓊脂(WA)塊上。取帶有單個孢子的水瓊脂塊，用接種針將其置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上。所得培養(yǎng)物在25 ℃斜面培養(yǎng)基上，避光培養(yǎng)。將該菌種培養(yǎng)7 d后，在無菌超凈工作臺上進行純化操作，挑取少量菌落邊緣新生菌絲移至新的PDA斜面培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，將純化菌種放在低溫冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 致病性測定

在室內條件下，選擇粗細大致相等的健康蒙古櫟枝條，用枝剪剪成20 cm左右的短枝，用流水仔細沖洗干凈后，再用酒精擦拭表面，按照柯赫氏法則，采用劃傷、燒傷和無傷3種接種方法對健康的蒙古櫟枝條進行接種。設置10組重復，用孢子懸浮液(1×105個/mL)浸泡的紗布，包裹刺傷、燒傷、無傷的枝條各20株，用浸泡無菌水的紗布包裹在枝條的刺傷、燒傷、無傷傷口處上，各取10株設為對照實驗組，在25 ℃、30%±5%的相對濕度下培養(yǎng)。接種24～48 h后，去除紗布，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。將接種后的枝條室溫培養(yǎng)，做好標記，觀察發(fā)病癥狀的變化情況。發(fā)病后采用孢子分離法從病斑上再分離、純化菌株。

1.5 病原菌形態(tài)學鑒定

取采集及新接種的患病枝條，切片鏡檢，在光學顯微鏡(XSP-12CA)下觀察病原菌形態(tài)，并利用電子顯微鏡觀察、測量分生孢子器、分生孢子梗和分生孢子數(shù)據(jù)，并拍攝顯微圖片。將病原菌接種于培訓基(PDA)上，25 ℃恒溫遮光培養(yǎng)，觀察記錄其生長速度、菌落顏色和形態(tài)。

1.6 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析

在PDA上培養(yǎng)用于提取DNA的分離物(培養(yǎng)約7 d)，用2 × T5 Direct PCR Plant Kit(高效的植物直擴試劑盒)從菌絲中提取基因組DNA。使用ITS1和ITS4引物擴增內部轉錄間隔區(qū)(ITS);核糖體大亞基(LSU)區(qū)域使用引物LR0R和LR7，TEF1-α基因使用引物TEF1-688f/TEF1-1251r擴增并測序[18]。

由青島生物科技股份有限公司(北京，中國)提供的PCR模板為50 μL，雙蒸餾水22 μL，引物1 μL, DNA模板1 μL, 2 × T5 Direct PCR Mix(Plant)25 μL。

ITS、LSU和TEF1-α的PCR反應條件為:94 ℃，5 min; 94 ℃，30 s；56.4 ℃，30 s；72 ℃，1 min，循環(huán)40次; 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，并由上海生工生物技術有限公司(上海)測序。

利用BLAST比對GenBank中保存的殼囊孢屬菌(C.ceratosperma)的其他序列。這些序列包括GenBank的參考序列，然后使用MEGA v.6手動編輯比對[19]。利用最大似然法和啟發(fā)式搜索來推斷系統(tǒng)發(fā)育關系。根據(jù)1 000次重復計算樹枝的Bootstrap支持值。相似度(%)使用MEGALIGN程序(DNASTAR Inc.)計算。本研究的所有序列數(shù)據(jù)均已存入GenBank。

2 結果與分析

2.1 蒙古櫟爛皮病癥狀

蒙古櫟爛皮病自然條件下多發(fā)生于幼齡或衰弱枝條上，單個枝條多處發(fā)生。病變部位最初呈淡紅色至紅褐色，后病斑擴大、顏色加深，呈淺褐色至深褐色凹陷病變，后期出現(xiàn)許多灰黑色至深黑色凸起，樹皮開裂，突破樹皮。每個子座上產(chǎn)生1個至多個分生孢子器，分生孢子器浸沒至半浸沒在樹皮中，有的具黃色分生孢子角。隨著病部擴散，整株植物都會死亡。如圖1所示。

圖1 蒙古櫟爛皮病癥狀和平板培養(yǎng)形態(tài)

2.2 病原菌致病性測定

致病性測定的結果顯示，燒傷處理的蒙古櫟枝條上在30 d后出現(xiàn)分生孢子器。發(fā)病癥狀經(jīng)觀察與野外采集標本一致，將接種發(fā)病后的枝條病癥處經(jīng)切片鏡檢，與野外病原菌一致。此外，刺傷處理組、無傷處理組、空白對照組均不發(fā)病。各接種方法的發(fā)病情況統(tǒng)計見表1。

表1 病原菌在蒙古櫟幼枝上3種不同接種方法的發(fā)病情況

2.3 病原菌形態(tài)特征

在25 ℃的PDA培養(yǎng)基中，遮光培養(yǎng)下的菌落最初呈白色、輻射狀、規(guī)則，缺乏氣生菌絲，7 d后變?yōu)殚蠙炀G至黃褐色，30 d后變?yōu)辄S褐色，菌落背面為灰色至灰黑色。分生孢子器不規(guī)則分布于表面，單生或聚集，呈乳突、黑色，菌絲為白色至淡黃色。部分有黃色分生孢子角。在25 ℃時，遮光培養(yǎng)24 h后PDA上菌落直徑達到9 mm，2 d為32 mm, 3 d為56 mm, 4 d為79 mm，5 d為90 mm，6 d為90 mm，如圖1(a)和圖1(b)所示。

圖2 病原菌無性形態(tài)特征

2.4 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析結果

引物ITS1/4 擴增測序ITS區(qū)域，引物LR0R/LR7和引物TEF1-688f/TEF1-1251r擴增并測序LSU、TEF1-α區(qū)域將所得基因登錄NCBI，得到登錄號(MW418308，MW418309)(MW425032，MW425033)和(MZ127836，MZ127837)，與殼囊孢屬菌(C.Ceratosperma)KY051985、AF408387、KP310860序列同源性分別為98%、100%、100%。然后使用MEGA v.7.0編輯序列。系統(tǒng)發(fā)育關系采用啟發(fā)式搜索的鄰接法(neighbor-joining method)進行推斷。基于1 000次重復計算了樹枝的Bootstrap支持值。相似度(%)用MEGALIGN程序(DNASTAR Inc.)計算，如圖3—圖5所示。結合形態(tài)學鑒定及相關文獻，鑒定此菌為殼囊孢屬菌(Cytosporaceratosperma)。

圖3 NEFU2019與其他Cytospora sp.和Diaporthe vaccinii ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 NEFU2019與其他Cytospora sp.和Leptosillia cordylinea的TEF-1α系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 NEFU2019與其他Cytospora sp.和Leptosillia cordylinea的LSU系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結論

本研究通過單孢分離法對蒙古櫟爛皮病病原菌進行分離純化，得到了菌株NEFU2019，根據(jù)柯赫氏法則對健康蒙古櫟枝條進行接種和再分離，確認了病原菌。結合形態(tài)學鑒定和系統(tǒng)發(fā)育結果，鑒定該病原菌為C.ceratosperma。根據(jù)記載[20]，該菌自然條件下，分生孢子器直徑800～1 400 μm，分生孢子梗13～22 μm。分生孢子(4.0～6.0)μm×(1～1.5)μm。分生孢子梗、分生孢子大小與本研究中測定結果接近，分生孢子器略大于測定結果1/3。推測差異與寄主以及分布區(qū)域的差異有關。

殼囊孢屬真菌分布廣泛，通常被視為寄主范圍廣泛的植物病原菌、內生菌或腐菌。作為植物病原體，主要與爛皮病有關，但也有其他疾病的報道，如紅棗根腐病和石榴環(huán)腐病。爛皮病癥狀包括樹皮中細長、輕微凹陷和變色的區(qū)域，通常沿著潰瘍邊緣分裂。癥狀因宿主種類和疾病發(fā)展階段而異。患病的內部樹皮和感染形成層上方的樹皮可能會凹陷，出現(xiàn)黃色、棕色、紅棕色、灰色或黑色的病斑，隨著組織的退化，變得潮濕且有氣味。形成層以下的木材被染成棕色[21]。組織病理學上，皮層和韌皮部的快速定植是通過寬的細胞間菌絲進行的，而細胞質在形成小室后被較窄的細胞內菌絲消化。

在本研究中，所有樣本均來自中國加格達奇地區(qū)。利用鄰域連接法和貝葉斯推理法對單個ITS數(shù)據(jù)集進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，并對部分C.ceratosperma進行了識別。利用ITS、LSU、TEF-1α區(qū)域對其進行了鑒定，并進行了驗證和說明。

蒙古櫟爛皮病是由C.ceratosperma引起的，這是中國范圍內首次報道由C.ceratosperma引起的蒙古櫟爛皮病。因此，該文提供的蒙古櫟爛皮病數(shù)據(jù)是初步的，今后研究重點將放在病原體的生物學特性上，這可能在抑制疾病的發(fā)生和傳播方面發(fā)揮不可或缺的作用。