基于生物信息學探討miRNA調控骨質疏松性椎體骨折的分子機制

張逢樂，楊輝

（廣州市荔灣區中醫醫院，廣東廣州510000）

骨質疏松性椎體骨折被認為是老年人群面臨的一個重大健康問題。骨質疏松癥導致的骨折幾乎占所有骨折病例的一半，對健康相關的生活質量有很大影響[1]。然而，這一估計可能低估了它們的真實患病率，考慮到只有四分之一的人得到了臨床關注，要么是由于缺乏放射學關注，要么是因為缺乏公認的經典癥狀[2]，以及他們的診斷不足[3]。令人擔憂的是，在最初的椎體骨折持續后，繼發性椎體骨折的比例高得驚人。據報道，在第一次脊椎骨折后的第一年，再次獲得脊椎骨折的風險高達20%[4]。相關研究表明，首次骨折后繼發椎體骨折的風險高達4-7倍，隨著先前椎體骨折的數量的增加呈正相關性增加[5-6]。

位于美國馬里蘭州貝塞斯達國立衛生研究院的校園內的GEO數據庫存儲了高通量測序等基因組數據，其由NCBⅠ建立和維護。近幾十年來，基因組水平的基因突變篩選廣泛借助微陣列技術和生物信息學分析，這有助于幫助我們識別與椎體骨折發生發展相關的差異表達基因和功能通路[7-8]。因此，本研究從GEO數據庫下載骨質疏松性椎體骨折miRNA微陣列數據集，并對其進行分析，以獲得骨質疏松性椎體骨折和健康人群之間的差異表達miRNA；通過GO富集、KEGG富集和蛋白質-蛋白質相互作用網絡分析，探討骨質疏松性椎體骨折發生和發展的分子機制。

1 材料和方法

1.1 基因芯片信息NCBⅠ-GEO被視為一個免費的基因芯片/基因圖譜公共數據庫，我們從中獲得了健康人群和骨質疏松性椎體骨折的miRNAs表達譜GSE93883，其包括6例健康患者血漿樣本（GSM2464440、GSM2464441、GSM2464442、GSM2464443、GSM2464444、GSM2464445）和6例椎體骨折患者血漿樣本（GSM2464452、GSM2464453、GSM2464454、GSM2464455、GSM2464456、GSM2464457）。

1.2 miRNA-mRNA調 控 網 絡 構 建TargetScan[9]、miRDB[10]兩個在線數據庫被應用于差異miRNA靶基因的預測，其交集的預測基因作為差異miRNA的靶基因。為了構建miRNA-mRNA調控網絡圖，我們借助cytoscape 3.7.0軟 件[11]，miRNA和mRNA作為節點，miRNA和mRNA的相互關系為連線，類三角形代表3個差異最明顯的miRNA，橢圓形代表靶基因。

1.3 PPⅠ網絡構建和集簇模塊分析PPⅠ網絡信息通過在線工具STRⅠNG（檢索相互作用基因的檢索工具）進行分析[12]，篩選條件medium confidence＞0.9，然后應用Cytoscape v3.7.0軟件構建差異表達基因的PPⅠ網絡。Cytoscape軟件是一款開源生物信息學軟件，可以對分子相互作用網絡可視化。集簇模塊分析借助MCODE插件完成[13]。其篩選條件為：Degree CUTOFF:2，Node Score Cutoff:0.2，Max Depth:100，K-Core:2。

1.4 GO和KEGG分析 基因本體論分析（GO）是定義基因及其RNA或蛋白質產物的常用方法，以確定基因組或轉錄組數據的生物學特性。KEGG是一組處理生物途徑、疾病、藥物和化學物質的數據庫集合。為了分析靶基因的作用機制，本研究使用R軟件、clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2包進行生物學分析和可視化。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GSE93883芯片集處理利用R軟件對GSE93883芯片集進行熱圖可視化（圖1），差異表達的miRNA包 括hsa-miR-205-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-4666a-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-4775、hsa-miR-4508、hsamiR-1273a、hsa-miR-1253、hsa-miR-4459、hsa-miR-1273f、hsa-miR-665、hsa-miR-4739、hsa-miR-4505、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-4522等。

圖1 GSE93883富集熱圖

2.2 DEmiRNA-基因調控網絡 對于預測的靶基因，本研究把Degree大于5作為進一步篩選的條件。通過本地軟件Cytoscape對miRNA-靶基因調控網絡進行可視化（圖2）。

圖2 miRNA-mRNA調控網絡圖

hsa-miR-205-5p的 靶 基 因 有YES1、YAP1、ⅤTⅠ1B、ⅤEGFA、TNRC6B、THBS1、TGFA、TAOK1、STON2、SORBS1、SMAD4、SMAD1、SⅠAH1、SH3GL3、SALL4、RPS6KA3、RNF4、RARA、RAP2B、RAB9B、RAB14、QKⅠ、PTPRJ、PTEN、PSMA4、PRKCE、PRKCA、PPP3R1、PLCB1、PJA2、PⅠCALM、PHC2、PAFAH1B1、NSF、NOTCH2、NECAP1、MPRⅠP、MGRN1、MGAT4A、MED13L、MED1、MDM4、LRP6、LPAR1、LAMC1、KMT2A、ⅠNSR、HERC3、H2AFJ、GCC2、GATA3、FBXO22、EZR、EREG、ERBB4、ERBB3、E2F1、DDX5、CSF1、CREB1、CNⅠH1、CLTC、CENPO、CENPF、CDK19、CDC27、CALU、AXⅠN2、ACTB、AAK1。

hsa-miR-660-5p的 靶 基 因 有YWHAH、YES1、UBE2H、TRⅠM71、TRAF6、STX16、SMARCA5、SKP1、SGⅠP1、SEC22C、SDC1、SAA1、RHOH、RAB33B、RAB11A、PPARGC1A、NR3C1、NCOR1、MEX3C、MED8、MDM2、LAMC2、KLHL11、KⅠF3A、KBTBD8、ⅠTGA1、ⅠRS1、HⅠP1、HⅠF1A、GOSR2、GORASP1、ETS1、EPAS1、DNAJC3、CUL5、COG6、CEP63、CENPM、CD47、ASB5、APP、APLP2、ANAPC5、AGO1。

hsa-miR-155-5p的靶基因有YWHAZ、YWHAE、XⅠAP、ⅤAⅤ3、TSPAN14、TRⅠM32、TLE4、TCF7L2、TAB2、SUFU、SPⅠ1、SOCS6、SOCS5、SOCS1、SMARCA4、SMAD2、SMAD1、SGⅠP1、SCG2、S1PR1、RPS6KB1、RPS6KA3、RNF123、RGP1、REPS2、RELA、RAP1B、RAB5C、RAB3B、QKⅠ、PTPRJ、PⅠCALM、PⅠAS1、NRG3、MAP3K7、KSR1、KRAS、KⅠF3A、HⅠF1A、HERC4、GRⅠP1、GATA3、FXR1、FOS、FBXO30、FBXO22、FBXO11、ETS1、E2F2、DYNC1Ⅰ1、DET1、DCUN1D3、CSF1R、COPS3、CNⅠH1、CKAP5、CHD9、CEBPB、CBL、BPⅠFB2、BDNF、ARRB2、APC、AGO4、ADAM10、ACⅤR1、ACTA1、AAK1。

2.3 蛋白互作網絡PPⅠ本研究借助String數據庫對靶基因完成蛋白互作網絡分析（PPⅠ），接著利用Cytoscape3.7.0軟件對蛋白網絡進行可視化（圖3）。該網絡含有371個節點，1175條邊。

圖3 PPⅠ網絡圖

2.4 重要基因的集簇模塊 通過MCODE插件對PPⅠ網絡進行分析，我們得出靶基因的集簇模塊（圖4）。集簇模塊1得分23.00，包含23個節點，253條邊；集簇模塊2得分9.52，包含26個節點，119條邊；集簇模塊3得分6.00，包含18個節點，51條邊；集簇模塊4得分5.89，包含19個節點，53條邊（表1）。通過集簇模塊得出重要的靶基因為：KLHL11、SⅠAH1、FBXO11、FBXO22、HERC4、HERC3、UBE2H、DET1、MGRN1、RNF4、CUL5、CDC27、ANAPC5、SKP1、FBXO30、KBTBD8、ASB5、PJA2、MEX3C、TRⅠM71、TRⅠM32、SOCS1、RNF123。

圖4 排名前4的集簇模塊

表1 集簇模塊所含的靶基因

2.5 GO富集分析和KEGG富集分析GO富集分析顯示，差異表達miRNA通過靶基因作用于椎體骨折的分子機制包括以下，其中生物過程為：翻譯后的蛋白質修飾、髓系細胞分化、調節造血作用、積極調節分解代謝過程、有絲分裂細胞周期相變的調控、類固醇激素反應、肌肉組織發展、細胞周期相變的調節等；細胞成分為：轉錄因子復雜、核染色質、有被小泡、谷氨酸的突觸、運輸囊泡、突觸前、RNA聚合酶ⅠⅠ轉錄因子復合物、主軸等；分子功能為：泛素樣蛋白轉移酶活性、泛素蛋白轉移酶活性、DNA結合轉錄激活因子活性、生長因子受體結合、泛素樣蛋白連接酶活性、核激素受體結合、激素受體結合等；Pathway信號通路為：PⅠ3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路、人類乳頭瘤病毒感染、小分子核糖核酸在癌癥、蛋白聚糖在癌癥、人類t細胞白血病病毒1感染等（表2、表3和圖5）。

圖5 GO和KEGG pathway富集分析

表2 GO富集分析結果

表3 KEGG pathway富集分析結果

3 討論

microRNA（miRNA）是轉錄后調節因子，可調節骨細胞中的多種細胞過程。由于最佳的miRNA靶向功能對其功能至關重要，因此miRNA（miRSNPs）或mRNA（PolymiRTS）基因座內或附近的單核苷酸多態性（SNP）可能會破壞miRNA-mRNA的相互作用，從而導致骨骼代謝改變和骨質疏松癥。最近的人類使用miRNA分析進行的骨骼特征研究，全基因組關聯研究和功能研究開始破譯復雜的miRNA調控網絡。這些研究表明，miRNA可能是有前途的骨標志物[14]。它們通過與目標mRNA（mRNA）分子堿基配對而獲得生物活性，從而在3'非翻譯區引導蛋白質復合物（稱為RⅠSC）。RⅠSC與mRNA序列的結合會導致mRNA降解或翻譯抑制[15]。本研究得出重要的miRNA分別為miR-205-5p、miR-660-5p、miR-155-5p。Roland Kocijan等通過多元分析證實miR-155-5p可作為骨質疏松癥脆性骨折的miRNA生物標志物[16]。研究證明骨質疏松癥樣品中miR-205-5p上調，RUNX2的過表達可顯著減弱miR-205-5p對成骨細胞標志物的作用，表明miR-205-5p可能通過靶向RUNX2抑制成骨細胞分化[17]。其中hsa-miR-205-5p的靶基因有YES1、YAP1、ⅤTⅠ1B、ⅤEGFA、TNRC6B等，hsa-miR-660-5p的靶基因有YWHAH、YES1、UBE2H、TRⅠM71、TRAF6等，hsa-miR-155-5p的 靶 基 因 有YWHAZ、YWHAE、XⅠAP、ⅤAⅤ3、TSPAN14等。本研究得出的miRNA-mRNA調控網絡可以成為后續研究的對象，為闡明骨質疏松性椎體骨折后續更深入的研究提供依據。

GO富集分析與KEGG pathway富集分析有助于更深入地認識并識別出miRNA靶向基因的功能和機制。本研究篩選出骨質疏松性椎體骨折的重要信號通路包括PⅠ3K-Akt信號通路、Ras信號通路和MAPK信號通路等。其中PⅠ3K-Akt通路與骨質疏松性椎體骨折有著密切的聯系，PⅠ3K/AKT信號的激活轉導上調成骨細胞分化標記基因的表達，包括BMP-2和ALP，從而促進OB的增殖、分化[18]。OB中PⅠ3K/Akt信 號 通 路 的 特 異 性 抑 制 劑LY294002可以阻斷PⅠ3K的激活，從而抑制OB增殖、鈣積累、ALP活性，還能抑制OCN，Osterix和Runx2 mRNA的表達[19]。PⅠ3K/Akt信號通路通過促進OB增殖、分化和骨形成從而參與OP的抑制。Rap1是調節細胞-細胞粘附，細胞-基質粘附和肌動蛋白重排的小型GTPase，在細胞擴散和內皮屏障功能過程中保持動態協調[21]。Rap1/MAPK信號通路可促進OB增殖分化并抑制其凋亡[21]。鍶可以通過激活Ras/MAPK信號通路和下游轉錄因子Runx2促進MSC的成骨分化[22]。成骨前細胞的ECM礦化和BMP-2誘導的多能間充質干細胞可以通過MAPK信號傳導途徑的微調來控制。此外，MEK-1抑制劑可用于促進骨形成，延遲骨折愈合的治療或骨折愈合后局部骨質疏松改變的進展[23]。

miRNA對其靶基因調控的研究在miRNA研究中尤為重要。本研究最終篩選出重要的靶基因包括SKP1、CBL、ANAPC5、FBXO30、KBTBD8、ASB5、SOCS1、KLHL11、FBXO11、FBXO22。SCF泛 素 連 接 酶 由Skp1，Cdc53，Hrt1和F-box蛋 白（FBP）組成[24]。磷酸化的β-連環蛋白被Skp1/Cul1/F-box（SCF）復合物識別，并被泛素化以被蛋白酶體降解[25]。CbL是銜接蛋白和E3連接酶，在影響各種細胞功能的幾種信號傳導途徑中起正負作用。廢除Cbl-PⅠ3K相互作用可增加骨形成和成骨細胞增殖[26]。AnapC5是ⅠL-17信號通路的新型銜接子和負調節劑，AnapC5沉默增強了ⅠL-17誘導的基因表達[27]。F-box蛋白與各種生物學過程相關，例如胚胎發育，成年骨形成和腫瘤發生[28]。miR-155通過SAPK/JNK途徑靶向SOCS1，從而調節TNF-α調控的成骨分化[29]。研究表明miR-433-3p是長鏈非編碼RNA SNHG14的直接靶標，并且直接靶向僅F-box蛋 白22（FBXO22）。敲 低FBXO22和SNHG14以及miR-433-3p的過度表達均能顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖，遷移和侵襲，但誘導細胞凋亡。miR-433-3p抑制劑減弱了SNHG14抑制對骨肉瘤細胞增殖，侵襲和遷移的抑制作用。SNHG14通過充當miR-433-3p的ceRNA來調節FBXO22的表達來促進骨肉瘤的進展，表明SNHG14可能成為治療骨肉瘤的潛在靶點[30]。

目前miRNA在骨折的研究較少[31]。本研究通過篩選骨質疏松性椎體骨折差異miRNA及其調控的靶基因深入研究，將有助于探索骨質疏松性椎體骨折的診斷和治療提供新的研究思路，并為骨質疏松性椎體骨折治療藥物的研發提供較為可靠的信號通路和作用靶點。然而，本研究尚存在一些不足之處，仍需要結合大量臨床樣本并進行相關的基礎實驗進一步驗證，方能完全明確這些差異miRNA和靶基因在骨質疏松性椎體骨折中的具體作用機制。