基于網絡藥理學方法探究銀杏二萜內酯葡胺注射液治療腦梗死的藥理學機制*

趙晨陽，郭利平

1 浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053；2 天津中醫藥大學

腦卒中是一種以腦部缺血和出血為主要損傷癥狀的疾病，分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中兩大類。其中，缺血性腦卒中較為常見，占腦卒中總數的80%，是導致殘疾及癡呆的重要原因之一［1］。腦卒中屬于難治性疾病，尚無十分有效的治療手段，急性期治療手段局限于溶栓治療。但仍然存在治療時間窗狹窄、副作用多等問題。恢復期則著重于神經修復和血管再生。銀杏是傳統的活血化瘀中藥，近年來隨著制藥技術的發展，銀杏類藥物組分逐漸明確，注射液純度提升，不良反應發生率下降。銀杏二萜內酯葡胺注射液（江蘇康緣藥業股份有限公司）是目前為數不多獲批上市的銀杏內酯化學單體注射液，其有效成分銀杏內酯A（Ginkgolide A）、B（Ginkgolide B）、K（Ginkgolide K）達99%以上。具有活血化瘀、通絡止痛的功效，臨床用于中風病中經絡（輕中度腦梗死）恢復期痰瘀阻絡證，癥見半身不遂、口舌歪斜、言語謇澀、肢體麻木等。根據中醫“祛瘀生新”理論，活血化瘀藥物的作用，可歸結于生新血、生新絡、生新物三個方面。其中血管在中醫學中屬于脈絡的范疇。喻昌有言：“十二經生十二絡，十二絡生一百八十系絡，系絡生一百八十纏絡，纏絡生三萬四千孫絡。”與現代醫學所描述的全身血管系統有異曲同工之妙。因此論治缺血性中風恢復期，當從“化瘀生新”著手。目前關于銀杏內酯類在腦卒中疾病中的保護作用主要集中于對急性期的研究，其在后期修復中發揮的作用亟待探索。本研究通過網絡藥理學對銀杏二萜內酯葡胺注射液的核心靶點、功能、信號通路進行分析，探索其作用機制，為藥物臨床應用提供進一步的理論依據。

1 資料與方法

1.1 化合物及靶點預測從PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載銀杏內酯A、B、K的3D結構，在PharmMapper上傳，靶點選擇Druggable Pharmacophore Models（v2017，16159），獲取預測的靶點，按可能性打分，自上而下分數逐漸降低，同時得到化合物分子結構與藥效團模型結合的圖形。

1.2 網絡構建1）將銀杏內酯A、B、K的相關靶點對應的基因名稱輸入STRING數據庫，物種限定為人，數據庫后臺計算蛋白相互作用的關系，并將其可視化，設置隱藏網絡中的離散節點，得到蛋白互作網絡（protein-protein interaction network，PPI network）。2）將基因和化合物信息輸入Cytoscape 3.7.1，繪制化合物-靶點藥物調控網絡，并以圖片的形式導出。3）基因功能和通路分析使用R語言軟件計算，得到基因本體論（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 銀杏二萜內酯葡胺注射液化合物及靶點預測根據PharmMapper結果，排除在UniProt數據庫中找不到對應基因名的靶標，預測銀杏二萜內酯葡胺注射液有效成分的靶點分別為Ginkgolide A 72個，Ginkgolide B 67個，Gink-golide K 78個，3D結構見圖1。

圖1 銀杏二萜內酯葡胺注射液有效成分3D結構

2.2 網絡構建

2.2.1 蛋白互作PPI網絡將銀杏內酯A、B、K的相關靶點導入STRING平臺，得到對應靶點蛋白互作PPI網絡。包括141個節點、264條邊，平均度值為3.74。其中節點為靶點蛋白，邊為各蛋白間互作關系。節點連接邊數越多代表其在網絡中的作用越重要。見圖2。

圖2 蛋白互作PPI網絡

2.2.2 化合物-靶點藥物調控網絡將基因和化合物信息輸入Cytoscape 3.7.1，繪制化合物-靶點藥物調控網絡，并以圖片的形式導出，即圖3。外圓圈為基因靶點，內部為藥效團，紅線代表藥效團的關系，藍線代表ppi網絡關系。見圖3。

圖3 銀杏二萜內酯葡胺注射液化合物-靶點藥物調控網絡

2.3 GO富集分析和KEGG通路富集分析銀杏二萜內酯葡胺注射液核心基因的GO功能主要涉及以下部分：熱休克蛋白結合、泛素（樣）蛋白連接酶結合、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）依賴的組蛋白脫乙酰酶活性、中樞神經特異性蛋白S100結合、NAD依賴性蛋白脫乙酰酶活性、熱休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）結合、雄激素受體結合、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶結合、微管相關蛋白tau結合、類固醇激素受體結合、核激素受體結合、組蛋白脫乙酰酶活性、蛋白質脫乙酰酶活性、組蛋白乙酰轉移酶結合、DNA結合受損、p53結合、酰胺結合、無序域特異性結合、輔酶結合、肽結合、組蛋白脫乙酰基酶活性（H3-K14特異性）、NAD依賴的組蛋白脫乙酰基酶活性（H3-K14特異性）、脂肽結合等。見圖4。

圖4 GO功能富集分析柱狀圖

其核心基因的KEGG通路主要涉及：代謝途徑、局部黏附、麻疹、人乳頭瘤病毒感染、前列腺癌、緊密連接、癌癥的途徑、病毒致癌、EB病毒感染、乙肝、Rap1信號通路、乙醛酸和二羧酸酯代謝、RNA轉運、MAPK信號通路、內質網中的蛋白質加工、碳代謝、黏附連接、單純皰疹感染、酮體的合成與降解、癌癥中的蛋白聚糖、色氨酸代謝、沙門氏菌感染、卟啉與葉綠素代謝、mRNA監測途徑、PI3K-Akt信號通路、Wnt信號通路、IL-17信號通路、孕酮介導的卵母細胞成熟、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路等。見表1。

表1 KEGG通路

3 討論

本研究基于網絡藥理學的理論，通過構建化合物-靶點藥物調控網絡，并對核心靶標進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，發現銀杏二萜內酯葡胺注射液的3種有效成分銀杏內酯A、B、K，核心靶標主要有FGF1、UNC45A、USP19、HDAC6、CDKN1B、KPNB1、HSP90AB1、DDX58、PAX6、SNX9、CUL5、CACYBP、RNF8、TRAF4、SIRT3、HDAC7、EZR、MARK1等。結合文獻研究，認為這些靶標可能通過代謝途徑、黏附連接、緊密連接、內質網中的蛋白質加工、病毒感染以及RAS相關蛋白1（RASassociated protein 1，Rap1）、促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activate protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，又 稱Akt）、無 翅/整 合（wingless/integrated，Wnt）、白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）、晚期糖基化終末產物及其受體（advanced glycation end products and receptor for advanced glycation end products，AGERAGE）等信號通路，影響熱休克蛋白結合、泛素（樣）蛋白連接酶結合、組蛋白脫乙酰酶活性、組蛋白乙酰轉移酶結合、S100蛋白結合、tau蛋白結合等功能，從而參與腦卒中的一系列生理病理過程。

缺血期間氧氣和ATP的消耗會引起錯誤折疊和未折疊的蛋白質積聚［2］，長期積累會導致錯誤締合、聚集或蛋白毒性可溶性肽的形成。組成細胞蛋白穩定機制反應的四個途徑包括熱休克蛋白，泛素-蛋白酶體系統，自噬-溶酶體途徑以及內質網相關降解壓力反應［3-5］。由GO和KEGG富集分析結果可知，銀杏二萜內酯葡胺注射液可以影響這四個途徑，促進清除蛋白質積聚，從而避免腦卒中的進一步發展。

研究表明，組蛋白的修飾，如組蛋白的乙酰化作用，在調控基因表達過程中發揮著重要作用。在細胞核內，組蛋白乙酰化與組蛋白去乙酰化過程處于動態平衡，并由具有相反活性的組蛋白乙酰化轉移酶和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）共同調控［6］。組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACI）在許多中樞神經系統疾病中具有保護神經的作用［7-8］。多項實驗結果顯示，組蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase-6，HDAC6）的抑制作用可以保護神經元和神經膠質細胞免受缺血性損傷，并促進中風后腦組織的恢復［9-13］。因此，銀杏二萜內酯葡胺注射液的腦神經保護作用，應與具有組蛋白脫乙酰酶活性、組蛋白乙酰轉移酶結合相關的核心靶點HDAC6、HDAC7、去乙酰化酶3（sirtuin-3，SIRT3）、配對盒基因6（paired box-6，PAX6）等有關。另外NIU［14］等研究表明，干預代謝、類固醇激素生物合成及其他途徑，對腦缺血性損傷可以起到協同保護的作用。

S100B蛋白（相關基因靶點為FGF1/CACYBP/EZR）是中樞神經系統發育過程中的神經營養因子和神經元存活蛋白，具有營養或毒性作用，具體取決于其局部濃度。相關研究證實，血清低水平S100B蛋白具有神經保護作用，但血清高水平S100B蛋白具有神經毒性［15］。在生理水平下，S100B蛋白可刺激神經突延伸，保護神經元存活，并在神經元成熟和膠質細胞體外增殖中發揮作用，保護因葡萄糖剝奪引發的細胞死亡和線粒體功能障礙［16］。當血清S100B蛋白水平較高時，S100B蛋白可刺激促炎癥細胞因子的表達，引起細胞凋亡，發揮其神經毒性作用，促進神經退行性疾病和神經炎癥的發展［17］。

與核心靶標MARK1、HDAC6、HSP90AB1等相關的tau蛋白，受MAPK通路調控。功能失調的tau是一種神經毒性蛋白，在缺血后的神經元和腦血管中積累，而且與缺血性卒中的一系列病理變化密切相關［18-19］。除此之外，p53/MAPK通路還可以通過磷酸化下游效應物的局部黏附激酶和Akt，保護中風后內皮細胞免于凋亡［20-21］。

作為腦缺血再灌注損傷機制里極其重要的一環，血腦屏障的重要組成部分——腦毛細血管內皮細胞，通過形成血漿和腦之間親水分子滲透屏障的頂端緊密連接（tight junctions，TJs），并與相鄰細胞的細胞骨架的黏附連接（adherens junctions，AJs）緊密相連［22］。與銀杏二萜內酯葡胺注射液密切相關的熱休克蛋白以及局部黏附、緊密連接等相關通路，可通過在腦缺血再灌注損傷后，阻止TJ和可能的AJ蛋白內皮細胞亞細胞再分布，來抑制血腦屏障損傷的細胞旁路［23］，從而起到腦保護作用。

近年來的文獻研究報道認為，EB病毒［24］、單純皰疹病毒［25］、乙型肝炎病毒［26］及Rap1［27］、PI3KAkt［28］、Wnt［29］、IL-17［30］、AGE-RAGE［31］等信號通路也參與了腦缺血再灌注損傷的一系列病理過程，因此根據銀杏二萜內酯葡胺注射液的KEGG富集結果，其治療腦梗死的相關機制應與以上通路有關。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學方法，全面系統地分析了銀杏二萜內酯葡胺注射液治療腦梗死的作用機制，為其臨床應用提供了理論依據，但仍需結合體內外實驗進一步驗證有效成分及靶標的作用機制，以期提高藥效，完善機制研究，從而促進中藥現代化發展。