制作高質量小鼠胃組織石蠟切片的方法優化

李 璐 李汝佳 李 琛 朱少平

（1.廣東醫科大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室，廣東 湛江 524023；2.廣東醫科大學基礎醫學院病理教研室，廣東 湛江 524023；3.廣東醫科大學附屬醫院檢驗科，廣東 湛江 524001；4.廣東醫科大學實驗動物中心實驗動物學教研室，廣東 湛江 524023）

0 引言

胃（stomach）呈囊狀膨大，空虛時呈收縮狀態，內面可見縱行的皺襞。進食后，由于肌組織舒張，胃腔擴張，皺襞消失，可暫時貯存食物。由于胃組織結構致密層次多，有較強的柔韌性和硬度，在制作高質量的石蠟切片過程中常見腺體結構不完整，黏膜各層次間隙大組織結構不清晰，平滑肌層肌束分離以及皺襞收縮脆裂較嚴重等現象。筆者在工作中通過多次試驗有效解決了這些問題，通過在制片方法上進行一些改進，獲得了良好的成像效果。采用健康C57BL/6小鼠胃部組織進行實驗操作（其和人類的胃在層次結構和組織學特點上都相似），Heidenhain Susa固定液固定，切片時蠟帶直接展片，最后四氫呋喃透明、脫蠟，蘇木素染色液和伊紅染液滴染。改進后的胃組織切片最大限度保持與活體組織相近的完整結構，核質著色均勻，制片時間縮短，值得推廣，現報道如下。

1 材料

1.1 實驗動物

購買健康C57BL/6小鼠30只，3月齡，體質量量30 g士3.5g，雌雄各半，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0008。小鼠隨機分為對照組，實驗組和常規組，每組各10只。

1.2 實驗試劑和儀器

Heidenhain Susa固定液（氯化汞4.5 g，氯化鈉0.5 g，三氯醋酸2 g，蒸餾水8Oml，37%甲醛溶液20m1，冰醋酸4 m1），放置于棕色試劑瓶內。10%福爾馬林溶液（30%甲醛10ml，蒸餾水90ml）。0.5%鹽酸乙醇液（濃鹽酸0.5 ml，70%乙醇溶液100 m1）。四氫呋喃分析純AR（成都科隆化學品有限公司）。蘇木精染色液，伊紅染液，環保型浸蠟脫蠟透明液，環保封片膠，購自北京索萊寶科技有限公司，高效切片石蠟（上海華永石蠟有限公司），粘附載玻片（25×75mm）（江蘇世泰實驗器材有限公司）。Leica RM2245電動進樣切片機，DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

2 方法

2.1 取材

小鼠禁食4h，2.5%戊巴比妥腹腔注射麻醉，蒸餾水浸濕小鼠胸部、腹部皮毛，將小鼠仰臥于解剖盤，解剖剪剪開腹腔，在胃賁門處和幽門處用止血鉗夾住，小解剖剪剪下整個胃，剪尖向上沿著胃小彎剪開，生理鹽水洗去胃內的殘存食物。

2.2 固定

在對照組A和實驗組B中，采用連續擺動超聲震蕩處理，震蕩頻率90次/min，將小鼠胃組織迅速放入Susa固定液中固定10h，待組織完全固定后，直接進行脫水。常規組C不采用振蕩處理，10%福爾馬林溶液常規固定10 h，固定后的胃組織置于廣口瓶內，瓶口用紗布纏繞包扎，將瓶子放置于自來水管下方，流水緩慢地由水龍頭經膠皮管注入瓶內進行沖洗，水量以組織塊在水中稍有移動為準。

2.3 脫水與透明

對照組A和實驗組B均無水洗，對照組A，放入95%乙醇液中脫水1h，用環保型透明液常規方法透明，實驗組B，放入95%乙醇溶液：四氫呋喃1∶1混合液1h、四氫呋喃1h，投入四氫呋喃-石蠟1∶2混合液（石蠟熔點6O℃）30 min。常規組C，采用常規脫水方法：70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、90%乙醇、95%乙醇溶液、100%乙醇溶液，每級各2h，環保型透明液透明0.5h。見表1。

表1 脫水與透明不同時間點比較

2.4 浸蠟與包埋

完全透明后的胃組織標本放置于石蠟I（熔點48℃～55℃）1.5h，石蠟II（55℃～60℃）1h，石蠟包埋（58℃～60℃）。對照組A和實驗組B置于6O℃恒溫震蕩儀中連續擺動震蕩，震蕩頻率120次/min。浸蠟時用預熱的小鑷子分別將對照組A、實驗組B和常規組C的胃組織放入包埋框內包埋。常規組浸蠟時不使用震蕩處理。

2.5 切片

對照組A和實驗組B，Leica RM2245電動進樣切片機，萊卡一次性刀片，切片刀的刀刃與蠟塊豎直平面之間夾角為5°，胃組織切片厚度4微米（μm），蠟帶分別裱在粘附載玻片上。將切片放置在60℃的電熱恒溫培養箱內進行展片，10min后胃組織自然展開貼附于載玻片上，烤箱內干燥2h。常規組C常規切片，水浴展片，攤片機水溫40℃借助水溫和水的張力，組織蠟帶平展后，用解剖小鑷子將石蠟切片一個個分開裱在粘附載玻片上，控去粘附載玻片上的水分，放入烤箱內干燥2h。通過對比，對照組A，實驗組B和常規組C三者組織切片形態結構基本相同，而相比于傳統水浴展片法，采用石蠟直接展片法大大縮短了展片時間。

2.6 染色

載玻片傾斜20°角放人立式染色缸中，對照組A使用環保型脫蠟液脫蠟、實驗組B使用四氫呋喃分析純AR浸泡10min脫蠟，對照組A和實驗組B組，梯度乙醇水化至下行70%乙醇溶液，蒸餾水浸洗3 min，蘇木精染液滴染15min，自來水洗去浮色，1%鹽酸乙醇溶液分色2S，0.5氨水（pH值7.5）藍化30S，自來水水洗，光鏡下觀察細胞核的分色質量，流水沖洗10min，伊紅染液染胞質30S，90、95、100%梯度乙醇速洗，每級乙醇各3min，四氫呋喃分析AR透明、環保封片膠封片。此過程除水洗和藍化在室溫下進行，其余步驟放置在56℃恒溫震蕩儀中，震蕩速度95次／min進行。常規組C采用常規方法染色，染色過程中不使用恒溫振蕩儀振蕩，環保型脫蠟液脫蠟，透明。

2.7 判斷標準合格標準

低倍鏡下完整呈現黏膜各層（見圖2）。不合格標準：低倍鏡下不能完整呈現黏膜各層或黏膜腺體呈圓環狀橫切面外觀（見圖5，圖6）。

2.8 統計學分析

采用SPSS18.0軟件對數據進行統計學分析，組間比較采用秩和檢驗分析。＞0.05，差異無統計學意義；＜0.05，差異有統計學意義。

3 結果

用LEICA Q550IW圖像分析系統對小鼠胃組織石蠟切片染色結果進行顯微鏡下觀察（染色結果見圖1～圖6）。

3.1 總體結果

對照組A和實驗組B，優質片84張（70%）、中等片36張（30%）、無次等片及不合格片；對照組無優質片，中等片12張（20.04%），次等片28張（46.71%），不合格片20張（33.33%）。實驗組B切片，結構完整程度好，著色優于對照組A。見表2。

表2 各組制片等級結果比較

3.2 染色效果

實驗組，第1組（圖1、圖3）和第2組（圖2、圖4）。圖1，肉眼觀察，胃外部形態完整，腔面高低不平，藍紫色為黏膜，外表層較平滑。藍紫色黏膜層靠近腔面，表面高低不平形成胃小區，粉色為胃壁其他結構。圖2，低倍鏡觀察，①黏膜，②黏膜下層，③肌層；圖3，圖4高倍鏡觀察，箭頭①上皮，箭頭②胃小凹，箭頭③胃底腺，箭頭④主細胞，位于腺體部和底部，呈藍紫色柱狀形，細胞核為圓形，箭頭⑤壁細胞體較大，呈圓形或三角形，細胞質染成紅色，位于細胞中央圓形的細胞核，有時在一個細胞中可見雙核。

圖1 肉眼觀察

圖2 胃底（4×10）

圖3 胃黏膜層（10×10）

圖4 胃黏膜層（40×10）

對照組（見圖5，見圖6），圖5，低倍鏡觀察，腺體結構模糊、黏膜各層次組織結構不清晰、層次間隙過大，平滑肌層肌束分離以及收縮皺褶脆裂較嚴重。圖6，高倍鏡觀察，核質染色模糊不清晰。

圖5 胃底（4×10）

圖6 胃黏膜層（40×10）

4 討論

由于胃組織結構致密層次多，有較強的柔韌性和硬度，在石蠟切片制作過程中常見各層組織結構不清晰、層次間隙過大，平滑肌層肌束分離以及收縮皺褶脆裂等現象。我們采用改良Heidenhain Susa固定液在組織固定后，無需流水沖洗，直接投入95%乙醇溶液，進行固定，可以大大縮短標本處理時間。

本實驗對固定、脫水、透明這三個步驟進行了改良，對照組，實驗組，常規組。對照組，使用Heidenhain Susa固定液固定、直接投入95%乙醇溶液脫水、環保型透明液透明，與常規實驗相比較，縮短實驗時間、透明效果較好。實驗組在進行固定、脫水、透明的步驟更改時，（即使用Heidenhain Susa固定液固定、無需水洗直接投入95%乙醇溶液脫水、四氫呋喃分析AR透明），縮短實驗時間，透明效果較好、組織無破碎、核質染色均勻。對照組和實驗組使用蠟帶展片，相對與常規實驗切片更平坦、清晰。

Susa固定液能迅速均勻的浸透組織標本內部，滲透力強，收縮硬化小，完整的保存細胞內部結構。固定時，進行超聲震蕩，因為將固定劑中的標本處于一定的震蕩頻率下，標本表面所形成的層流就會被破壞而表現為湍流狀態，相對增加固定劑對標本的滲透速度。超聲震蕩、恒溫控制技術可以促使胃組織及有機溶劑或預熔石蠟高速震蕩，出現周期性的縮張活動，以有機溶劑代替組織內水分，并促使預熔石蠟浸入組織內時間縮短，最大限度控制固定、脫水、浸蠟等操作時間，縮短標本制作的時間。四氫呋喃具有脫水透明的效果，使組織收縮程度小，整塊組織不用切割修整直接包埋。乙醇是常用的脫水、脫脂劑，乙醇分子中的極性基團羥基（-OH）可以與組織細胞內的水形成氫鍵將水置換出來從而起到脫水作用。組織脫水應逐步進行，順序顛倒會影響脫水效果；在無水乙醇中不可以放置時間太長，會引起組織過硬，使切片的時候組織破碎；更換脫水劑時，浸泡時間需減去吸水過程中所耽誤的時間，以免脫水不足；脫水必須在有蓋的玻璃瓶中進行，防止吸收空氣中的水分和酒精揮發，保證脫水徹底。標本脫水時振蕩對脫水時間的確定也有影響，振蕩可促進標本固定。

浸蠟期間更換一至兩次新蠟液，可以徹底去除透明劑成分，保證標本浸蠟的質量。此過程操作動作要迅速，因為容器內的液體石蠟容易凝固，相對縮短浸蠟時間，半凝固的石蠟不具備置換透明劑和浸透標本的作用。注意包埋框的內面應干凈平滑，邊緣沒有向內凸起的棱角，不要使蠟液凝固，用半凝固的石蠟進行標本包埋，石蠟內部會產生許多小氣泡影響石蠟對組織結構的支撐性。蠟帶直接展片無需在生物組織攤片機中水展片使蠟帶組織在水中更容易破損。染色時使用單獨滴染（HE染色），試劑不重復使用，保證每張切片都使用新鮮試劑。每張切片染色時采用滴染式操作，與傳統的浸染式操作相比，避免了標本與試劑之間相互污染。同時，保證了染色效果的均一性，無傳統染色中染色到后期深淺不一的現象。

綜上，經過結合Heidenhain Susa固定液固定、四氫呋喃透明和蠟帶展片，既可縮短實驗時間，也避免人為因素和其他因素，提高了快速石蠟切片的質量穩定性，有利于快速石蠟切片的質量控制工作。