HPLC法測定益腎續骨片中川續斷皂苷VI的含量

周婷婷，梁志云，張俊杰，蔣三元，張健民

（江門市新會區中醫院，廣東江門 529100）

益腎續骨片為江門市新會區中醫院制劑（粵藥制字Z20071123），由龍骨、黃芪、續斷、煅自然銅、淫羊藿、三七、巴戟天、土鱉蟲、當歸等十二味中藥制成。全方具有養血通經、強壯筋骨、補益肝腎、接骨續筋的功效，主要用于骨折、關節脫位中、后期及肝腎不足諸癥。臨床應用理想，對于中醫院的中醫骨傷?？破鹬P鍵作用。但該制劑在成品質量控制方面,還是缺少對某些中藥指標性成分的測定。為了進一步控制制劑的內在質量，查詢到該制劑處方中的主要藥材續斷在《中國藥典》中采用川續斷皂苷VI 的量控制藥材的質量[1]，在中成藥的質量控制中也有以續斷皂苷VI 含量為指標的研究報道[2-7]。故本文經由HPLC 來測定分析益腎續骨片中川續斷皂苷VI的含量。建立益腎續骨片中續斷皂苷VI 的含量測定方法，完善益腎續骨片質量標準資料，能夠更好地保證制劑的有效性和安全性。現將結果報告如下：

1 儀器和試藥

高效液相色譜儀（島津LC-20A，日本）；電子天平（HZK-FA210，福州華志科學儀器有限公司）；超純水器（MILLIPORE，默克）；超聲波清洗器（Jeken PS-10，潔康超聲波清洗機有限公司）。

川續斷皂苷Ⅵ對照品（樂美天醫藥|德思特生物，批號：DST191126-041,含量：92.3%）；益腎續骨片（江門市新會區中醫院制劑，批號分別為：20210826,20211008,20211104），陰性樣品（按照益腎續骨片的處方比例和制備工藝，制備不含續斷的陰性對照品）；甲醇、乙腈為分析純，水為純化水。

2 定量分析

2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-XP 柱（4.6×150 mm，5 μm）;流動相：乙腈-水溶液（27:73）;檢測波長為212 nm;柱溫為30℃;流速為1.0 mL/min;進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 準確稱定適量川續斷皂苷Ⅵ對照品,并置于容量瓶（20mL）內，加入甲醇（MT），實施5min 超聲，充分溶解，并定容到20ml，搖勻，得到川續斷皂苷Ⅵ對照品液儲備液。準確吸量此液1 mL，并移至量瓶（10 mL）內，通過流動相定容到10ml，搖勻，得到川續斷皂苷Ⅵ對照品液，質量濃度為89.75 μg/mL。

2.2.2 供試品溶液 準備10片益腎續骨片,將糖衣除掉，借助研缽研細,再過篩（4號）,準確稱定2g左右,放到具塞錐形瓶里,準確放入10ml的MT，稱定重量,實施0.5h 的超聲操作（頻率、功率各為40kHz、100W）,待溫度下降，進行第2 次稱重，加入MT將重量補齊,先搖勻,再濾過。準確量取5ml的續濾液，放到容量瓶（50 mL）里，用流動相定容到50ml，搖勻，用0.45μm 的有機微孔濾膜進行濾過處理，得到供試品液。

2.2.3 陰性對照溶液 根據益腎續骨片的處方比例與配制技術，配制無續斷成分的陰性對照品；參考“2.2.2”項所示，制備陰性對照液。

2.3 系統適應性試驗考察 于上述色譜設定下，分別精準吸取對照品液、陰性對照液、供試品液。在保留時間與峰型上，供試品和對照品相同，陰性對照未見干擾。具體如圖1-3所示。

圖1 川續斷皂苷VI對照品溶液

圖2 供試品溶液

圖3 陰性對照溶液

2.4 線性關系考察 精密吸取川續斷皂苷Ⅵ對照品溶液儲備液0.4、0.5、1.0、2.0、4.0 mL,分別置于10 mL 量瓶中,用流動相稀釋后搖勻，制成濃度分別為35.9、44.875、89.75、179.5、359 μg/mL 的溶液。各對照品液的進樣量皆為10μl，根據上述色譜設定實施測定，對于川續斷皂苷Ⅵ對照品濃度，通過峰面積開展回歸計算,橫坐標為進樣量X，縱坐標為峰面積Y，經由回歸計算確定回歸公式：Y=2139X+2612.4，r（相關系數）為0.9999。結果顯示，在以上色譜條件下，川續斷皂苷Ⅵ處于35.9 至359 μg/mL 范圍時,具良好線性。如圖4 所示。

圖4 川續斷皂苷Ⅵ線性關系圖

2.5 精密度考察 取濃度為89.75 μg/mL 的川續斷皂苷Ⅵ對照品溶液,按照“2.1”的色譜條件,連續進樣6 次,進樣量為10 μL,測定樣品中川續斷皂苷Ⅵ的峰面積的RSD 為1.29%，表明儀器精密度良好。見表1。

表1 川續斷皂苷Ⅵ對照品精密度

2.6 穩定性考察 取同一益腎續骨片供試品溶液,分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h，按照“2.1”項下條件進樣，測定川續斷皂苷Ⅵ的峰面積。結果川續斷皂苷Ⅵ的RSD 值等于1.60%，可見1 天內供試品液具良好穩定性。如表2所示。

表2 益腎續骨片的穩定性試驗

2.7 重復性試驗 精密稱取同一益腎續骨片樣品2 g(批號為20211008),共5 份,按照“2.2.2”項下的方法同法制備成供試品溶液,按“2.1”項色譜條件測定并計算對照品的含量。結果川續斷皂苷Ⅵ的含量均值是3.9814 mg/g，RSD 等于1.06%,可見此法具良好重復性，與含量檢測要求相符。如表3所示。

表3 益腎續骨片的重復性試驗

2.8 回收率試驗 分別準確稱定適量含量已確定的益腎續骨片（批號“20211008”，含川續斷皂苷Ⅵ量是3.9814 mg/g）樣品，合計6 份，經由加樣回收法，分別準確添加一定量的川續斷皂苷Ⅵ對照品，參考含量測定項所示步驟，表4所示為具體結果。

表4 益腎續骨片中川續斷皂苷Ⅵ的加樣回收率（n=6）

2.9 樣品含量測定 檢測3 批次益腎續骨片樣品中川續斷皂苷Ⅵ的含量，下表所示為具體結果。

表5 益腎續骨片中川續斷皂苷Ⅵ含量測定結果（n=3）

3 討論

益腎續骨片是江門市新會區中醫院的傳統中藥制劑，具有養血通經、強壯筋骨、補益肝腎、接骨續筋的功效，主要用于骨折、關節脫位中、后期及肝腎不足諸癥,是骨科專科的特色制劑，臨床應用反映效果好。續斷為此方一大組分，也有“和尚頭”之稱，是多年生草本植物、川續斷科Dipsacus asper Wall.ex Henry（川續斷）的干燥根。此藥材味苦辛、性微溫，歸腎經、肝經，作用為止崩漏、補肝腎、續折傷、強筋骨。川續斷的成分以生物堿類、三萜皂苷類、揮發油、環烯醚萜類、其它類化合物為主[8]。其中三萜皂苷類是川續斷中的主要化學成分，而川續斷皂苷Ⅵ為三萜皂苷類中含量最高的成分[9]，川續斷皂苷Ⅵ（asperosaponinⅥ）又稱木通皂苷D（Akebia saponin D），簡稱ASD[10]，亦有文獻稱其為續斷皂苷C。李廣潤等[11]研究表明其藥理作用有神經保護作用、心肌保護作用、預防骨質疏松作用、鎮痛作用等。因此，在益腎續骨片的制劑過程中，確保續斷皂苷Ⅵ的含量的穩定，控制好片劑的質量，對保障益腎續骨片的安全有效，具有實際的臨床意義。

益腎續骨片組方藥味較多，成分復雜，主要解決益腎續骨片中川續斷皂苷VI成分提取分離的適宜方法，能有效的分離續斷皂苷VI成分，在含量測定中其他藥材成分不產生干擾，真實的測定續斷皂苷VI成分含量。參考《中國藥典》續斷項所示含量測定步驟與相關研究成果[2-7]，0.5h 的超聲時間基本可實現充分提取，同時較易操作，最后采用MT 超聲法，于0.5h 內完成供試品的制備。參考《中國藥典》續斷項所示含量測定步驟與相關研究成果[2-7]，通過在200～300 nm 波長范圍內的全波段掃描，確定川續斷皂苷Ⅵ吸收峰值見于波長212nm 附近，最后明確測定波長為212 nm。實驗操作過程中曾按《中國藥典》續斷項下的含量測定方法：流動相為乙腈（ACN）-水（30:70）進行測定，但由于本方含10種以上的藥材，存在較多雜峰，不能實現較好的分離度，經過多次實驗測定結果，比較了不同比例的乙腈（ACN）-水系統，最終將流動相確定為乙腈（ACN）-水，且比例為27:73，顯示較平基線，較好分離度，良好峰形，川續斷皂苷Ⅵ保留時間在21.8min 左右，此時間適宜，同時陰性對照未見干擾。為了使益腎續骨片的質量標準更具完善性，對其臨床用藥的有效性、安全性施以有效保障，研究發現，通過HPLC 法來測定益腎續骨片內川續斷皂苷Ⅵ含量，3 批樣品的含量皆≥3.7mg/g，其加樣回收率均值等于98.74%，RSD 等于1.26%。此法具較好重復性、精確性，同時結果可靠，在對益腎續骨片內川續斷皂苷Ⅵ含量測定與制劑質量控制方面具備應用價值。