孕壹方君藥中黃芪甲苷的藥代動力學研究

張泳嫻，麥煥庭

（佛山市婦幼保健院，廣東佛山 528000）

孕壹方為筆者所在單位主治不孕不育、著床困難、經血不調的臨床驗方，該方由黃芪、黨參、大棗、綿茵陳等藥味組成，起補氣活血、養陰調經、暖宮促孕的作用。研究表明，上述作用與方中君藥黃芪的功效活性密切相關。黃芪中所含的黃芪甲苷、毛睿異黃酮葡萄糖苷、黃芪皂苷等成分，均能夠起到增強體質、促進新陳代謝和血液循環、抗氧化和激活細胞增殖的藥理作用[1-6]。因此，在含黃芪類中藥方劑和中成藥的功效機制、制備工藝、藥效物質等研究中，常以黃芪中的活性成分尤其是黃芪甲苷為指標[7]。

為更好地了解孕壹方中黃芪甲苷被生物（大鼠）口服后的吸收、分布、代謝、排泄情況，筆者擬對其開展口服藥物代謝動力學研究，并根據研究結果，進一步驗證該成分能否被生物體充分吸收、利用，為孕壹方的藥效評價和功效機制研究提供科學依據。

1 儀器、試藥和材料

UPLC-Xevo 型超高效液相色譜-質譜聯用儀（美國Waters 公司），N-240 干式氮氣吹掃儀（上海那艾精密儀器有限公司），5425R型低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司），MT 型電子精密分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）。黃芪甲苷對照品（批號：110781-202118）和維拉帕米對照品（批號：100223-200102）均購自中檢院；孕壹方所用黃芪、黨參、大棗、綿茵陳等藥材飲片購自華潤三九藥業股份有限公司；實驗用甲酸、乙腈、甲醇等色譜純試劑購自德國Merck 公司，去離子水為法國Millipore 凈水機制備。SPF 級SD 大鼠購自廣東實驗動物中心，許可證號SYXK（粵）2018-0001，飼養條件為溫度25℃±2℃、濕度50%±5%，日常給予清水和大鼠飼料養育7天以上。

2 方法和結果

2.1 試藥制備 取處方量黃芪、黨參、大棗、綿茵陳等藥材飲片，加水適量煎煮兩次，每次1h，合并煎液，濾過后濃縮至≤200mL，轉移至250mL 量瓶中，加水定容至刻度，即得。

2.2 血樣采集 取SD 大鼠，雌雄各半，灌胃給予10mL 孕壹方藥液，給藥后于0、5min、10min、15min、30min、60min、90min、2h、3h、4h、6h、12h、24h 分別通過尾緣靜脈取血，血樣轉移至預加肝素的EP管中，-20℃保存，備用。

2.3 血樣處理方法 取血樣，每份樣品精密吸取100μL，置于容量為1.5mL 塑料EP 管中，加含0.1% 甲酸的乙腈溶液300μL，13000rpm 離心10min 后，精密吸取上清液300μL，轉移至另一干凈1.5mL 塑料EP 管中，氮氣吹干，加入100μL 內標溶液（含100ng/mL 維拉帕米和0.1%甲酸的甲醇溶液，下同），13000rpm 離心5min，精密吸取上清液80μL，作為供試品溶液。

2.4 樣品檢測方法 使用Waters ACQUITY UPLC BEH 300 C18 色譜柱（2.1×100mm，1.7μm），色譜柱溫度為40℃，流速為0.3mL/min，流動相為A（含0.1%甲酸的乙腈溶液）和B（0.1%甲酸水溶液），ESI 離子源，正負離子同時檢測的MRM 模式，梯度洗脫條件為，0～0.5min，95%→66% B；0.5～1.0min，66%→30% B；1.0～2.0min，30%→0%B；2～2.5min，0→95% B；2.5～3.0min，95%→95%B，進樣2.0μL，檢測離子對為黃芪甲苷785.6/143.1（CE：20V），維 拉帕米455.0/165.0（CE：25V）。標準添加血樣和藥動學樣品LC-MS 圖譜見圖1。

圖1 血漿標準添加溶液（含黃芪甲苷100ng/mL，內標100ng/mL）及峰值（4.00h）血樣LC-MS圖譜

2.5 方法學考察

2.5.1 線性 取黃芪甲苷對照品，加甲醇配成濃度為20μg/mL 的溶液。吸取上述溶液，加空白血漿配成濃度為1μg/mL 的血漿標準添加溶液，將該血漿標準添加溶液繼續加空白血漿逐級稀釋，配成濃度分別為500、200、100、50、20、10、5、2ng/mL的血漿溶液。吸取上述溶液（含濃度為1μg/mL的溶液）100μL，轉移至1.5mL 塑料EP 管中，按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測血藥濃度，根據待測物（黃芪甲苷）和內標（維拉帕米）的峰面積計算峰面積比，以峰面積比（x）對濃度（y）做線性回歸，得方程為y=193.28x-3.0437（r2=0.9962）。上述結果表明，檢測方法線性良好，能夠對2～1000ng/mL 血藥濃度范圍的樣品進行準確測定。

2.5.2 靈敏度 取“2.5.1”項下配制的血漿標準添加溶液，逐級稀釋至1ng/mL，吸取上述溶液100μL，轉移至1.5mL 塑料EP 管中，平行配制6份，按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測血藥濃度，根據待測物（黃芪甲苷）和內標（維拉帕米）的峰面積計算峰面積比，并計算血藥濃度、回收率和回收率的RSD。結果顯示，平均回收率為100.31%，RSD 為11.79%，表明方法靈敏度良好。

2.5.3 精密度和準確度 制備3 個濃度各6 份QC樣品（黃芪甲苷濃度分別為800、100、5ng/mL的血漿標準添加溶液，下同），吸取上述溶液100μL，轉移至1.5mL 塑料EP 管中，平行配制6 份，按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測血藥濃度，根據待測物（黃芪甲苷）和內標（維拉帕米）的峰面積計算峰面積比，并計算血藥濃度、回收率和回收率的RSD。結果顯示，平均回收率為95.11%～102.30%，RSD 為5.07%～10.50%，表明方法精密度和準確度良好。

2.5.4 穩定性 分別考察常溫、進樣器、凍融、長期穩定性四個項目，每個項目均使用QC 樣品（濃度和數量同“2.5.3”部分）。常溫穩定性考察方法為：QC 樣品放置于常溫（25℃）下8h 后，按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測血藥濃度；進樣器穩定性考察方法為：QC 樣品按“2.3”所述方法制備供試品溶液，在LC-MS 自動進樣器中放置2h 后，再按“2.4”所述方法檢測血藥濃度；凍融穩定性考察方法為：QC 樣品凍存于-20℃，取出，解凍后再次放入冷凍，循環三次，按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測血藥濃度；長期穩定性考察方法為：QC 樣品凍存于-20℃，30 天后取出，解凍后按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測血藥濃度。根據上述項目所測得待測物（黃芪甲苷）和內標（維拉帕米）的峰面積計算峰面積比，并計算血藥濃度、回收率和回收率的RSD。結果顯示，平均回收率為95.43%～108.28%，RSD為5.05%～10.11%，表明方法所制備樣品穩定性良好。

2.5.5 基質效應 分別考察溶劑和血漿基質效應。溶劑基質效應考察方法為：使用含0.1%甲酸的甲醇溶液為溶劑制備QC 樣品，按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測；血漿基質效應的考察方法為：取空白血漿，按“2.3”所述方法操作至“氮氣吹干”，殘渣加前述溶劑為甲醇的QC 樣品溶液復溶，繼續處理，所得供試品溶液按“2.4”所述方法檢測。根據上述項目所測得待測物（黃芪甲苷）和內標（維拉帕米）的峰面積計算峰面積比，并計算血藥濃度、回收率和回收率的RSD。結果顯示，平均回收率為95.48%～102.31%，RSD 為5.62%～12.54%，表明方法樣品基質干擾排除能力良好。

2.6 血藥濃度測定和藥代動力學參數計算 取“2.2”項下所得血樣，按“2.3”所述方法制備供試品溶液，再按“2.4”所述方法檢測，據上述項目所測得待測物（黃芪甲苷）和內標（維拉帕米）的峰面積計算峰面積比，并計算血藥濃度。所得結果導入DAS2.0 軟件中，計算藥代動力學參數，并使用Graphpad 軟件繪制血藥濃度-時間曲線（圖2）。結果顯示，Tmax=4.00h，Cmax=223.2636ng/mL，T1/2=2.577h，MRT=4.294h，AUC0-i=795.331mg/L·h，AUC0-t=834.236mg/L·h。上述結果表明，大鼠口服孕壹方湯劑后，能夠較為充分地吸收其中所含的黃芪甲苷，且該成分在體內的吸收、分布、代謝、排泄情況較為適宜其發揮藥理活性，表明對黃芪甲苷進行藥代動力學研究能夠較好地反映孕壹方的體內運動過程和發揮功效的機制。

圖2 黃芪甲苷血藥濃度-時間曲線（n=6）

3 討論

由藥代動力學數據可知，黃芪甲苷達峰時間和平均駐留時間較長（4h 和4.429h），表明服藥后該成分在大鼠體內代謝速度較慢，即發揮最大效用所需時間較長。同時，由圖2 及藥動學中Cmax、AUC 等參數可知，黃芪甲苷血藥濃度在大鼠體內上升較為平緩，但同時吸收較為充分，可以達到較為適宜的血藥濃度，上述結果與文獻報道及相關藥理、藥性研究基本相符[7-9]，從藥動學層面證明了黃芪性微溫這一中醫藥理論。同時，圖2 的血藥濃度曲線也表明，孕壹方中黃芪的作用較為溫和，對機體傷害小，適宜于孕婦或備孕婦女使用。

通常情況下，黃芪甲苷的測定受到提取方法復雜、檢測手段較為特別（如高效液相色譜需使用蒸發光散射檢測器）等原因，較難實現與黃芪中其他成分同時測定。本文使用LC-MS法，預實驗結果顯示，黃芪甲苷信號強度較好，圖譜中無明顯干擾，表明黃芪甲苷能夠實現較為充分的離子化，可在質譜中與其他成分實現同時測定，為后續孕壹方及其他含黃芪藥物的多指標同時測定提供了科學依據[9]。

色譜條件選擇方面，原先使用不含0.1%甲酸的乙腈為流動相；所用樣品溶劑中，甲醇也不含甲酸。但預實驗中發現，黃芪甲苷信號強度較弱，在濃度較低時難以與干擾實現基線分離。因此，在有機相中加入甲酸，同時適當調整液相梯度，確保黃芪甲苷峰在洗脫前于柱內充分富集；在進入質譜時則受流動相和酸度、離子強度影響充分離子化，確保最大限度提高信號響應，增強了檢測靈敏度。