蛇菰多糖減輕急性脊髓挫傷模型大鼠的神經元損傷

趙方毓，覃曉莉，何一多，王鳳杰，唐鮮娥，彭新鑫，陳顯兵*

(1.湖北民族大學附屬民大醫院 病理科，湖北 恩施 445000； 2.湖北民族大學 醫學部， 湖北 恩施 445000；3.湖北恩施學院 醫學院， 湖北 恩施 445000)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是各種外界因素導致的脊髓組織不同程度的急性損傷，可引起損傷平面以下的軀體感覺、運動功能障礙。自損傷開始，SCI經歷原發性損傷、繼發性損傷及損傷慢性期等階段。繼發性損傷可逆、可控，其病理過程影響著SCI的病程發展，其中細胞自噬(autophagy) 在該階段的作用是目前較為熱門的研究內容[1]。神經元是神經系統結構和功能的主要成分，死亡后無法再生，因此在繼發性損傷期保護神經細胞、減少神經元凋亡是治療的核心問題[2-4]。蛇菰多糖(Balanophorapolysaccharide, BPS)為筒鞘蛇菰的提取物，研究表明，BPS具有良好清除自由基、抗氧化、抗凋亡等細胞保護作用[5]。已證實BPS具有拮抗D-半乳糖誘導的肝損傷作用[6-7]。目前尚無BPS在神經損傷中藥效的研究和報道。本實驗通過構建急性脊髓損傷模型大鼠，旨在探討BPS對脊髓挫傷的治療作用和機制，為藥物的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

主要材料與試劑：蘇木精、伊紅染料盒尼氏染色液，BCA法蛋白濃度檢測試劑盒、PBS緩沖液和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術有限公司)；PVDF膜(Millipore公司)、辣根過氧化物酶標記的抗兔和抗小鼠IgG 抗體(二抗)、β 肌動蛋白抗體(一抗)和LC3A/B 兔源單克隆抗體(一抗)(Santa Cruz公司)；SQSTM1/p62抗體(一抗)(Abcam公司)；BECN 1抗體(Cell Signaling Technology公司)；ECL化學發光顯色試劑盒(Thermo公司)。

SPF級雄性SD大鼠80只，體質量120～150 g，湖北省實驗動物研究中心，許可證號:[SCXK (鄂) 2015-0018]。

1.2 方法

蛇菰多糖的提取與純化：筒鞘蛇菰(Balanophorainvolucrata)經湖北民族大學武陵山中藥材檢驗檢測中心鑒定。洗凈烘干、搗碎成粗粉。75%乙醇浸泡蛇菰粗粉24 h后離心去溶劑，粉末再次干燥。再按蛇菰粗粉/去離子水為1/10的比例將蛇菰粗提取物反復浸泡、煮沸、離心并收集上清液，2～3遍。合并上清液行減壓濃縮至1 L。所得濃縮液加入無水乙醇，低溫靜置過夜再次離心分離沉淀。沉淀以水溶解后再次離心除去不溶物，濾液減壓濃縮后再加入無水乙醇洗滌3次，50 ℃烘干，得純蛇菰多糖。苯酚-硫酸法測得多糖含量為61.3%。

大鼠的分組及處理：將大鼠分為假手術組(sham，n=10)、模型組(SCI，n=15，用改良Allen’s脊髓撞擊法[8])、BPS干預組(BPS,n=45)。BPS組再分低、中、高3個劑量組，于術后2 h開始每天分別用25、50和100 mg/kg的BPS(n=15/組)灌胃14 d。

BBB評分評估運動功能：脊髓損傷后采用雙盲法、隔日對各組大鼠進行Basso、Beattie，Bresnahan (BBB)運動測評，以評估后肢運動功能恢復情況。每天觀察3次，每次時間為5 min，以3個記錄數據的均值進行統計。根據BBB評分的多少可以將脊髓組織損害程度等級分為6個級別：A(0分)為完全性損害；B(1～7分)為重度損傷；C(8～14分)為中度損傷；D(15～18分)為輕度損傷；E(19～20分)為輕微損傷；F(21分)為正常[9]。

HE及尼氏染色法檢測形態學：取大鼠損傷段脊髓(T9～T11)行HE及尼氏染色，觀察脊髓損傷和神經元形態、數量，分布等情況。

Western blot 檢測Beclin 1、LCS Ⅱ、p62、β-actin等蛋白表達：提取損傷段脊髓組織總蛋白。按既定程序行SDS-PAGE電泳、蛋白印記轉PVDF膜、5%脫脂牛奶封閉、PBS洗膜后一抗(β-actin，1∶1 000；LC3A/B，1∶1 000；BECN 1，1∶800；SQSTM1/p62，1∶800)4 ℃孵育過夜。次日PBS洗膜3次，再加入HRP標記的二抗(IgG，1∶5 000) 37 ℃孵育4 h，再次PBS洗膜3次。最后采用化學發光法檢測目標蛋白的表達。數據結果以目標蛋白/β-actin的吸光度值來分析蛋白的相對表達情況。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 SCI大鼠運動功能的評估

sham組的BBB評分正常。SCI組評分-時間曲線明顯低于sham組，第14日仍為重度損傷(P<0.05)。BPS組評分增長曲線呈劑量依賴性高于SCI組(圖1)。

2.2 大鼠脊髓組織的形態變化

SCI組大鼠的脊髓背側白質和中央灰質均有嚴重損傷：組織呈現海綿狀，出現廣泛水腫、細胞壞死，可見炎性細胞浸潤，內見空洞形成。低劑量BPS組第14天的脊髓形態改善不明顯，中、高劑量BPS組脊髓結構較清晰，細胞水腫及壞死減輕，空洞面積明顯減少(圖2)。

the relative change of BBB scores-time curve; *P< 0.05 compared with sham group on day 14; #P<0.05 compared with SCI group on day 14圖1 脊髓損傷后各組大鼠BBB評分評估神經功能Fig 1 Neurological function evaluated by the BBBscores after spinal cord injury

與sham組相比，SCI組的神經元數量明顯減少，胞體結構不完整，顏色淺淡，組織炎性反應較重。BPS組神經元數量比SCI組增多，胞體較大，結構相對完整，尤其是中、高劑量BPS組的神經元數量和胞體結構較SCI組有所改善。

A.hematoxylin-eosin staining on day 14(×40)；B.Nissl staining on day 14(×400); arrow showed positive cell圖2 各組大鼠治療第14天脊髓形態學改變Fig 2 Hemorphological changes of spinal cord on day 14 of each group

2.3 各組大鼠脊髓組織自噬標記蛋白的表達變化

與sham相比，SCI組LC3 Ⅱ表達上調，第7日表達最高(P<0.05)，而Beclin 1表達下降，于第7天表達最低(P<0.05)。另外，自噬降解底物p62在SCI發生后表達持續增加，于第7天表達最高(P<0.05)(圖3A)。

與SCI相比，BPS組Beclin 1和LC3-Ⅱ在第7、14天均表達上調(P<0.05)，同時自噬降解底物p62的表達下降(P<0.05)。上述蛋白的相對變化水平隨BPS劑量的增加而更加明顯(圖3B)。

A.protein expression levels of Beclin1, LC3 Ⅱ/Ⅰ and p62 in sham and SCI groups; B.protein expression levels of Beclin1, LC3 Ⅱ/Ⅰ and p62 in SCI and BPS groups; *P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with SCI group

3 討論

自噬是脊髓損傷后發生改變的細胞過程之一[10]。細胞內的異常蛋白、功能失調的細胞器可通過這一高度保守的溶酶體依賴性過程進行清除。自噬是一個復雜動態過程，從自噬信號啟動、形成自噬小體、自噬體與溶酶體融合至分子降解以及再利用稱為自噬能通量[11]。通量的破壞會導致受損細胞內損傷細胞器和異常蛋白的蓄積,從而干擾細胞的功能，并可能導致細胞的死亡[11-12]。作為終末分化性細胞，神經元、少突膠質細胞等細胞的自噬對自身質量控制十分重要[13]。在SCI患者中，挫傷性損傷患病率極高。本研究以大鼠脊髓挫傷為疾病模型，對SCI進程中的自噬過程進行初步探索，發現在亞急性期(損傷7 d)自噬體的形成(LC3 Ⅱ/Ⅰ)逐漸增加，但負性蛋白p62并沒有下降，而是升高。同時在此階段出現自噬啟動不足,提示自噬能通量在SCI進程中存在異常。這與既往的研究結果[14-15]一致。目前尚不清楚這一異常自噬活動的機制。

大量研究報道了BPS在肝損傷、疲勞等方面的拮抗作用，但是否具有神經保護作用尚不清楚，本研究證實了3種劑量的BPS均具有抗脊髓損傷、促進功能恢復的作用，尤其是在亞急性BPS功能改善作用更明顯。 盡管細胞自噬在SCI繼發性損傷階段是一個非常重要的病理過程，但當存在自噬能通量異常時，會加重神經細胞的功能障礙，甚至最終導致細胞死亡[14]。BPS可以增強損傷組織中的自噬啟動，降低負性蛋白的表達，表明BPS可以通過調節自噬能通量這一途徑拮抗脊髓損傷。

綜上所述，本研究證實了筒鞘蛇菰活性提取物BPS可以改善大鼠脊髓損傷后的運動功能障礙，通過增強損傷組織中的自噬啟動，降低負性蛋白的表達，調節自噬能通量異常等途徑來保護神經，拮抗損傷。本研究為臨床應用保護神經功能的用藥及BPS藥物的開發提供一定的依據。