高血壓視網(wǎng)膜病變患者外周血單個核細(xì)胞Notch1水平及其與血管內(nèi)皮功能的相關(guān)性

游 慧，康海軍，陳 方，李 恒

(遂寧市中心醫(yī)院 眼科, 四川 遂寧 629000)

高血壓是中國常見的心血管疾病，其發(fā)病人數(shù)呈逐年上升趨勢，已成為亟待解決的健康難題[1]。高血壓會引起全身系統(tǒng)多種器官損傷，視網(wǎng)膜病變是常見高血壓繼發(fā)疾病之一。高血壓視網(wǎng)膜病變(hypertensive retinopathy，HRP)無特征性眼部改變，且進(jìn)展隱匿，不易被發(fā)現(xiàn)，雖然其病理表現(xiàn)多為視網(wǎng)膜局部微小動脈硬化和繼發(fā)改變，但是對中動脈、大動脈病變有提示意義，HRP也被認(rèn)為與高血壓導(dǎo)致心、腦、腎等病變呈正相關(guān)[2]。因此，研究HRP中的血管病變機制對該病診斷、治療具有積極意義。Notch1信號通路參與多種疾病的病理生理調(diào)控[3]，研究發(fā)現(xiàn)Notch1蛋白通過上下游信號傳導(dǎo)可促進(jìn)新生血管生成、血管硬化[4]，其表達(dá)異常可能與心血管疾病、動脈硬化等相關(guān)[5]。本研究測定HRP患者單個核細(xì)胞中Notch1及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)因子表達(dá)，以期明晰在HRP中Notch1與血管內(nèi)皮功能病變的可能關(guān)系，為HRP血管病變機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇及分組

1.1.1 一般資料：選擇2020年1月至2020年9月遂寧市中心醫(yī)院就診的HRP患者42例為研究對象(HRP組)，其中男23例，女19例；年齡38～68歲，平均年齡(62.1±7.5)歲，病程2～9年，中位病程5年。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考《中國高血壓防治指南2010》[6]中關(guān)于HRP的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)經(jīng)過眼科醫(yī)生專業(yè)檢查，并符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；2)具備完整臨床資料；3)無意識障礙，可配合完成相關(guān)診斷檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)合并糖尿病患者；2)其他疾病導(dǎo)致的視網(wǎng)膜病變；3)惡性高血壓；4)合并腫瘤患者；5)妊娠期或哺乳期女性。另選擇同期遂寧市中心醫(yī)院體檢科行健康體檢者30例為對照組，其中男18例，女12例；年齡40～65歲，平均年齡(59.5±6.2)歲。兩組患者在一般資料比較中無明顯差異，具有可比性。所有研究參與者均知曉本研究目的、過程及意義，簽署知情同意書。本研究得到遂寧市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，編號：LLSLH20200073。

1.1.2 HRP分期：Ⅰ期：患者視網(wǎng)膜血管尤其是小分支血管變窄、收縮；Ⅱ期：患者視網(wǎng)膜動脈硬化明顯，血管存在普遍和局限性縮窄，可出現(xiàn)動靜脈交叉征；Ⅲ期：患者眼底出現(xiàn)出血、棉絮樣滲出現(xiàn)象，并存在廣泛微血管改變；Ⅳ期：在Ⅲ期病變基礎(chǔ)上伴視盤水腫和動脈硬化的各種并發(fā)癥。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集：所有入組者取空腹靜脈血3～5 mL×2管。其中一管無抗凝劑，于室溫下靜置約30 min后3 500 r/min離心10 min，收集血清保存于-80 ℃待測。另一管EDTA抗凝，用于提取單個核細(xì)胞：ETDA靜脈血等體積與0.9%氯化鈉溶液混勻，加入5 mL單個核細(xì)胞分離液(碧云天生物科技有限公司)，離心30 min，取單個核細(xì)胞層以PBS清洗、離心10 min，2～3次，收集細(xì)胞，保存于-80 ℃待測。

1.2.2 Notch1的mRNA測定：1)采用RNA提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取單個核細(xì)胞總RNA；2)采用Taq Man反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄；3)real-time PCR實時熒光定量反應(yīng)體系：使用TaqTM試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，以β-actin為內(nèi)參。Notch1引物序列：上游5′-TGCTGAACTGCACT GCTGGTGTACC-3′，下游：5′-ACTGCACTGCTAGCTA CGATTGTGTCAC-3′；β-actin引物序列：上游：5′-GATCATTGCTCCTCTG GAGC-3′ ，下游：5′-CACCTT CACCGTTCCAGTTT-3′。所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。Ct表示熒光達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)，以2-△△Ct表示Notch1基因的相對表達(dá)量。

1.2.3 血清血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、人內(nèi)皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)測定：血清VEGF、IGF-1、ET-1、NO均采用試劑盒進(jìn)行測定(碧云天生物科技有限公司)，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 Notch1蛋白的測定：免疫印跡測定Notch1在單個核細(xì)胞中表達(dá)。選擇提取成功的單個核細(xì)胞，加入RIPA裂解液(碧云天生物科技有限公司)，按照試劑盒說明提取總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離，然后將蛋白樣本轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，兔抗人Notch1單克隆抗體(1∶1 000)(碧云天生物科技有限公司)4 ℃過夜；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2 000)(碧云天生物科技有限公司)室溫孵育1 h。ELC發(fā)光液顯影，分析實驗結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Notch1 mRNA表達(dá)水平

HRP組Notch1的mRNA表達(dá)明顯低于對照組(P<0.01)。HRPⅠ期(12例)、Ⅱ期(10例)患者間無明顯差異；但是Ⅲ期(10例)、Ⅳ期(10例)患者呈明顯下降趨勢(P<0.01)(圖1)。

2.2 Notch1蛋白表達(dá)

HRP組Notch1的蛋白表達(dá)明顯低于對照組(P<0.05)。HRPⅠ期(12例)、Ⅱ期(10例)患者間無明顯差異；但是Ⅲ期(10例)、Ⅳ期(10例)患者呈明顯下降趨勢(P<0.05)(圖2)。

2.3 血管新生因子水平、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能比較

HRP組VEGF、IGF-1水平顯著高于對照組(P<0.05)，且隨著分期增加而顯著增加(P<0.05)。HRP組ET-1水平顯著高于對照組、NO水平顯著顯著下降(P<0.05)，且隨著分期增加ET-1水平顯著升高(P<0.05)、NO水平顯著下降(P<0.05)(表1，表2)。

2.4 Notch1的mRNA水平相關(guān)性分析

HRP組Notch1的mRNA水平與VEGF(r=-0.534，P=0.000)、IGF-1(r=-0.375，P=0.014)、ET-1(r=-0.491，P=0.001)呈顯著負(fù)相關(guān)，與NO呈顯著正相關(guān)(r=0.413，P=0.006)。

2.5 HRP影響因素分析

以患者是否發(fā)生HRP為因變量，以Notch1、VEGF、IGF-1、ET-1及NO為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，Notch1、NO低水平是HRP發(fā)生的危險因素(P<0.05)，VEGF、IGF-1、ET-1高水平是HRP發(fā)生的危險因素(P<0.05)。

3 討論

Notch1信號通路是人體內(nèi)高度保守的信號傳導(dǎo)機制，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖及凋亡[3]。本研究分析HRP患者外周血單個核細(xì)胞Notch1表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其比對照組明顯下降，進(jìn)一步分析其蛋白水平也得到相似結(jié)果，提示Notch1的異常低表達(dá)可能參與HRP發(fā)病。由于Notch1參與血管生成過程，如血管細(xì)胞增殖、分化、遷移及平滑肌細(xì)胞分化等， Notch1可能在高血壓相關(guān)疾病發(fā)病過程中起重要作用。有研究[7]證實血管內(nèi)皮細(xì)胞Notch1的減少可能是血管炎性反應(yīng)和動脈粥樣硬化發(fā)病的誘因之一。在高血壓相關(guān)疾病發(fā)病過程中，Notch1可能是一種保護(hù)性因素[8]。此外，高表達(dá)Notch1可明顯減輕急性青光眼視網(wǎng)膜受的損傷[9]。本研究結(jié)果也證實，隨著HRP分期增加，Notch1水平明顯下降，這可能與Notch1的保護(hù)性作用缺少有關(guān)。

*P<0.01 compared with the control group； #P<0.01 compared with phase Ⅰ圖1 HRP組與對照組的Notch1mRNA水平Fig 1 Notch1 mRNA levels of HRP group and control group[M(Q25, Q75), n=72]

*P<0.05 compared with the control group； #P<0.05 compared with phase Ⅰ圖2 HRP組與對照組的Notch1蛋白水平Fig 2 Notch1 protein levels in HRP group and control n=72)

表1 HRP組與對照組VEGF、IGF-1、ET-1及NO水平比較Table 1 Comparison of VEGF, IGF-1, ET-1 and NO levels between HRP group and control n=72)

表2 HRP組不同分期的VEGF、IGF-1、ET-1及NO水平比較Table 2 Comparison of VEGF, IGF-1, ET-1 and NO levels in HRP group at different n=42)

微血管形成是各種原因致視網(wǎng)膜病變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而VEGF、IGF-1都是血管形成不可或缺的因子[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，HRP患者較對照組血清VEGF、IGF-1水平明顯升高，并且隨著疾病嚴(yán)重程度增加而明顯增加；同時，在血管內(nèi)皮細(xì)胞功能比較中也發(fā)現(xiàn)HRP患者血清ET-1明顯升高、NO明顯下降，表明HRP患者血管內(nèi)皮功能明顯衰退，均與其他研究結(jié)果[11,13]相符。Kazuya等[14]將Notch1基因敲除小鼠用于構(gòu)建缺氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型，發(fā)現(xiàn)Notch1基因敲除小鼠肺動脈高壓明顯加重，其機制研究證實此現(xiàn)象可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管內(nèi)皮功能減退有關(guān)。在本研究中，Notch1水平與VEGF、IGF-1、ET-1呈顯著負(fù)相關(guān)，與NO呈顯著正相關(guān)，提示Notch1可能與新生血管形成、血管內(nèi)皮功能減退有一定關(guān)系。進(jìn)一步的危險因素分析發(fā)現(xiàn)Notch1水平低下是HRP發(fā)生的危險因素。結(jié)合相關(guān)研究[8-9,14]，推測可能原因在于：Notch1水平下降，在高血壓對視網(wǎng)膜損傷過程發(fā)揮的保護(hù)性作用減弱，因此導(dǎo)致新生血管形成、血管內(nèi)皮功能減弱，進(jìn)而出現(xiàn)視網(wǎng)膜損傷。

綜上所述，Notch1水平下降可能與高血壓導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損傷密切相關(guān)，并且是HRP獨立危險因素。由于本研究納入病例較少,未進(jìn)行多中心研究，因此尚不能判斷Notch1對HR是否具有早期診斷價值，還需要進(jìn)行多中心病例研究，同時開展基礎(chǔ)機制研究，以期進(jìn)一步明確Notch1在HRP發(fā)病過程中的作用及對該病的早期診斷價值。