rL-RVG抑制人小細胞肺癌細胞系NCI-H446的增殖及遷移

梁 冰，嚴玉蘭

(1.昆山市中醫醫院 呼吸科，江蘇 昆山 215300； 2.江蘇大學附屬人民醫院 呼吸科，江蘇 鎮江 212000)

小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)是惡性程度較高的惡性腫瘤之一，雖然目前免疫治療對其部分有效，但很多患者因經濟原因或其不良反應而無法耐受免疫治療。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是最常見且最具潛力的溶瘤病毒之一[1]。NDV可以選擇性地殺死腫瘤細胞而不影響正常細胞，因它在癌細胞中復制效率是正常細胞的10 000倍[2]。前期實驗研究發現重組新城疫病毒rL-RVG[3]能夠抑制肺腺癌細胞系A549的增殖，并有促凋亡作用[4]，而且rL-RVG能夠影響A549細胞系的遷移及活動減弱[5]，但rL-RVG對人小細胞肺癌細胞系NCI-H446的作用機制不詳，本實驗主要探討rL-RVG對SCLC細胞增殖及遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

NDV LaSota系、rL-RVG(哈爾濱獸醫研究所)；人小細胞肺癌細胞系NCI-H446(上海生命科學研究院細胞庫)；胎牛血清、DMEM細胞培養基(維森特生物技術有限公司)；HRP-兔抗雞二抗(Earthox公司)；FITC-山羊抗鼠二抗、Cy3-山羊抗雞二抗(康為世紀生物科技股份有限公司)；兔抗E-cadherin、兔抗MMP2 抗體(博士德生物工程有限公司)；核熒光染料(Hoechst33342)、MTT(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光法檢測病毒蛋白的表達：將NCI-H446細胞接種在高溫滅菌后的蓋玻片上，將蓋玻片放入24孔細胞培養皿中培養，加入稀釋好的rL-RVG及NDV病毒液，恒溫箱過夜，洗滌，固定，再洗滌，封閉，加入雞抗NDV(1∶150)一抗或小鼠抗狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein，RVG)(1∶100)一抗，加入Cy3-山羊抗雞(1∶300)二抗或FITC-山羊抗鼠(1∶100)二抗，細胞核用0.2 μmol/L Hoechst 33342作用30 min，封片。于熒光顯微鏡下觀察細胞中的標志物：FITC(綠色)、Cy3(紅色)和Hoechst 33342(藍色)。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖：rL-RVG及NDV病毒液的滴度在雞胚半數感染量為109.8EID50/mL[3-5]。將rL-RVG和NDV用DMEM培養基(不含血清)稀釋至10-1、10-2、10-3和10-4濃度，將增殖期的NCI-H446細胞接種在96孔細胞培養皿，100 μL/孔，在rL-RVG組及NDV組分別加入相應的病毒稀釋液，PBS組為陰性對照組[4]，詳細過程見參考文獻[5]。重復實驗3次。計算細胞增殖抑制率[4-5]：細胞活力值=(實驗組平均A值/空白對照組平均A值) ×100%。

1.2.3 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力：根據參考文獻[5]中方法進行細胞處理，用無菌200 μL槍頭在細胞層中縱向劃線，將PBS、NDV(10-3稀釋度)、rL-RVG(10-3稀釋度)分別感染細胞24 h，光鏡下觀察劃痕寬度。

1.2.4 Transwell小室法檢測細胞遷移能力：在24孔板的Transwell上室內每孔加入100 μL增殖期NCI-H446細胞懸液，下室分別加入含rL-RVG(10-3稀釋度)、NDV(10-3稀釋度)的DMEM液600 μL，對照組加入DMEM液600 μL，37 ℃培養1 d，擦去Transwell上室聚碳酸酯膜表面的細胞，沖洗后用4%多聚甲醛固定上室細胞15 min，再次沖洗后用結晶紫染色20 min，選取5個不同視野，在倒置熒光顯微鏡下(×200)計數穿膜細胞，求平均值。

1.2.5 免疫熒光法檢測遷移途徑：按照1.2.1實驗步驟處理rL-RVG組、NDV組和對照組，后加入E-cadherin、MMP2一抗及對應的二抗，加核熒光抗體后在熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 RVG及NDV蛋白在細胞內的表達

在熒光顯微鏡下可見，RVG蛋白及NDV蛋白均可在細胞中穩定表達，NDV熒光蛋白表達量在rL-RVG組較NDV組多(圖1)。

圖1 rL-RVG和NDV感染NCI-H446細胞24 h后RVG蛋白及NDV蛋白的表達

2.2 rL-RVG對細胞增殖的影響

rL-RVG病毒液及NDV病毒液被稀釋成不同濃度，rL-RVG和NDV均對細胞的增殖有一定的抑制作用；病毒濃度越高，對癌細胞的抑制作用越強；rL-RVG對小細胞肺癌細胞的抑制效果強于NDV(P<0.05)(圖2)。

*P< 0.05 compared with NDV group圖2 不同濃度的rL-RVG和NDV對NCI-H446細胞增殖的影響Fig 2 Effect of rL-RVG and NDV at different solubilities on cell proliferation of NCI-H446

2.3 rL-RVG對細胞遷移能力的影響

rL-RVG、NDV及PBS感染細胞劃痕后24 h，細胞的遷移距離分別為(465±40)μm、(739±7)μm及(1 505±13)μm，rL-RVG組細胞遷移距離顯著小于NDV組及對照組(P<0.05)(圖3)。

rL-RVG組及NDV組穿過小室的細胞數明顯少于對照組(P<0.05)(圖4)。

相較于對照組及NDV組，MMP2的熒光強度在rL-RVG組中減弱(P<0.05)，而E-cadherin 熒光強度升高(P<0.05)(圖5)。

3 討論

小細胞肺癌的侵襲與轉移是其治療失敗的原因之一，嚴重影響患者的治療效果。新城疫病毒(NDV)隸屬禽副黏病毒屬，是一種主要感染禽類的雞瘟病毒[1]。根據NDV在禽類中的致病性，可以被分為3個主要致病型：低毒株、中毒株和強毒株， 其中NDV LoSata系是低毒株， 亦是本實驗選其的原因之一。有臨床試驗表明NDV野生株在各種實體腫瘤治療中未見明顯的不良反應[6]，rL-RVG具有安全、高免疫活性、穩定表達的特點[3]。本實驗結果顯示，rL-RVG能在NCI-H446細胞中穩定表達，抑制細胞增殖，并且NDV熒光蛋白表達量在rL-RVG組中較NDV LaSota組多。在劃痕實驗及Transwell小室法中，rL-RVG明顯抑制NCI-H446細胞的遷移，較NDV作用強。細胞遷移是惡性腫瘤侵襲和遷移的關鍵步驟之一[5,7]，上皮細胞間質轉化與癌細胞的侵襲和轉移關系密切[5,8]。參與上皮細胞間質轉化的重要調控因子有MMP2和E-cadherin。MMP2在細胞外基質的合成、降解過程中發揮重要作用，其降解細胞外基質的功能是腫瘤細胞侵襲和轉移的基礎，與腫瘤上皮細胞間質轉化的發生密切相關[9-10]。MMP2在SCLC中表達較高[11]。E-cadherin是一種鈣依賴性的跨膜蛋白，參與細胞與細胞間黏附，可以激活鈣黏蛋白，促進橋粒連接形成，能夠參與維持細胞的極性和完整性[5,8]。上皮細胞間質轉化的產生與E-cadherin的異常表達直接相關，在癌侵襲中起著重要作用[5]。本研究發現，rL-RVG感染NCI-H446后影響MMP2及E-cadherin的表達，從而抑制小細胞肺癌細胞的遷移。

圖3 劃痕實驗檢測rL-RVG和NDV對NCI-H446細胞遷移的影響Fig 3 Effect of rL-RVG and NDV on migration of NCI-H446 cells detected by scratch test(×40)

arrow pointed to NCI-H446 cells; *P< 0.05 compared with control group

A:immunofluorescence analysis of MMP2 and E-cadherin protein expression: a-c.MMP2 of PBS，NDV and rL-RVG group，respectively, d-f.E-cadherin of PBS，NDV and rL-RVG group，respectively; B:single cell fluorsence intensity of MMP2, *P<0. 05 compared with control and NDV group; C:single cell fluorsence intensity of E-cadherin,*P<0. 05 compared with control and NDV group