新疆維吾爾族尋常型銀屑病患者皮損組織中miR-21高表達

王慧琴，趙 洋，吳衛(wèi)東

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 科研教育中心， 新疆 烏魯木齊 830000)

銀屑病(psoriasis) 是一種慢性、復(fù)發(fā)性炎性系統(tǒng)性疾病,難以根治，常罹患終身[1-2]。其臨床表現(xiàn)為鱗屑性紅斑或斑塊分布，目前銀屑病的發(fā)病機制尚不明確，可能的發(fā)病誘因與遺傳、環(huán)境、精神心理等因素相關(guān)。新疆地區(qū)銀屑病高發(fā)，且因地域、種族、生活習(xí)慣的不同具有自身的特殊性：與代謝性疾病相關(guān)的銀屑病在本地區(qū)表現(xiàn)為易于復(fù)發(fā)，難于治療、累及關(guān)節(jié)損害患者增多。隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中微小RNA(microRNA)異常表達與疾病密切相關(guān)[1-3]。目前關(guān)于miR-21調(diào)控靶蛋白Bcl-2在尋常型銀屑病中的作用研究鮮有報道。本研究以 miR-21為切入點，探究其在健康人群與維吾爾族銀屑病患者皮損組織中的表達差異，以及靶蛋白Bcl-2的表達情況。進一步轉(zhuǎn)染HaCaT細胞探討miR-21對靶蛋白的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例選擇：選取2013年至2019年間在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科確診的51例維吾爾族尋常型銀屑病患者為實驗組，其中男性26例，女性25例，年齡為8～70歲，平均年齡為(34.3±14.0)歲；對照組來自泌尿外科、整形外科等無皮膚疾病的患者，本研究中取其手術(shù)中切除的多余皮膚組織，共選擇維吾爾族29例，其中男性18例，女性11例，年齡為8～66歲，平均年齡為(24.3±27.4)歲。所有樣本均用于免疫組化檢測分析，其中對照組和實驗組各15例。納入標準：所有銀屑病患者均經(jīng)組織病理檢測確診，具有典型皮損癥狀。排除標準：患者在3個月內(nèi)使用過維A酸類藥物、糖皮質(zhì)激素等；合并嚴重心臟、肝、腎等疾病者；合并其他免疫性及腫瘤性疾病者；停止光療及外用藥物治療>1個月以上；女性患者排除月經(jīng)期、妊娠期及哺乳期。正常對照組均排除銀屑病家族史，且無遺傳性疾病史及自身免疫性疾病史。此次研究經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準(審批號：KY2020041048)，參與患者均自愿參加，且簽署知情同意書。

1.1.2 試劑：人永生化角質(zhì)形成細胞系HaCaT(南京凱基生物公司)，核酸提取miRNeasy Mini kit、反轉(zhuǎn)錄miScript Ⅱ RT kit、實時熒光定量miScript SYBR? Green PCR kit 試劑盒(Qiagen公司)；Bcl-2單克隆抗體、鼠兔通用型二抗試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；BCL抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測miR-21：取凍存組織樣本提取總RNA，按照說明書操作執(zhí)行。提取的樣本總RNA濃度及純度使用Thermo超微量核酸蛋白測定儀進行測定。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)體積為20 μL，37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。應(yīng)用試劑盒檢測miR-21表達，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min，1個循環(huán)；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，40個循環(huán)。計算2-△△Ct。樣本重復(fù)3個復(fù)孔，基于相同條件下檢測miR-21和U6，miR-21引物序列5′-GTGCAG GGTCCGAGGT-3′。擴增結(jié)束后采用軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 免疫組化法檢測Bcl-2蛋白表達：石蠟切片使用二甲苯脫蠟及梯度乙醇進行脫水，用Envision二步法染色；PBS緩沖液沖洗；pH6.0的檸檬酸緩沖液修復(fù)15 min，PBS緩沖液沖洗；室溫下加入過量過氧化氫孵育10 min，在此期間使用蒸餾水沖洗，PBS浸洗；滴加一抗Bcl-2，稀釋濃度為1∶500，孵育，4 ℃冰箱貯藏過夜；滴加二抗，室溫孵育45 min，使用PBS緩沖液沖洗；DAB顯色30 s內(nèi)終止；而蘇木精使用鹽酸分化，經(jīng)過脫水透明后使用中性樹膠封片。結(jié)果判斷：Bcl-2蛋白的陽性顯色表現(xiàn)為表皮基底層細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。結(jié)果判定評分是由兩名高級職稱病理醫(yī)師進行獨立雙盲閱片得出。

1.2.3 Western blot檢測Bcl-2蛋白表達量：HaCaT細胞培養(yǎng)：含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中添加100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)。miR-21 mimic和miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染時將細胞匯合度控制為40%～60%，轉(zhuǎn)染過程根據(jù)說明書執(zhí)行。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，RIPA裂解細胞，之后采用BCA法對蛋白濃度測定。SDS-PAGE電泳分離蛋白樣本，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5%蛋白質(zhì)干粉TBST封閉1 h，TBST洗膜3次，10 min∕次，一抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜如上述操作。二抗同樣如此。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析，實時熒光定量PCR結(jié)果采用LSD法分析。計量資料使用t檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR檢測miR-21

miR-21在維吾爾族尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達水平高于對照組(P<0.05)。miR-21在維吾爾族尋常型銀屑病皮損旁組織中的表達要低于皮損組織(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with para-lesion圖1 尋常型銀屑病皮損、皮損旁組織及正常皮膚中miR-21的表達水平Fig 1 Comparison of miR-21 expression levels in lesions, para-lesion of psoriasis vulgaris and normal skin

2.2 免疫組化結(jié)果

Bcl-2蛋白陽性表達定位于胞質(zhì)，在尋常型銀屑病與對照組中均有陽性表達。其中對照組中表皮棘層細胞表達有27例，占陽性表達率93.10%(27/29)；在維吾爾族尋常性銀屑病組中有18例在表皮棘層細胞表達，陽性表達率為35.29%(18/51)。兩組數(shù)據(jù)經(jīng)卡方檢驗分析，實驗組即銀屑病組陽性率明顯低于正常皮膚組織(P<0.001)(圖2，表1)。

2.3 Western blot結(jié)果

miR-21轉(zhuǎn)染HaCaT細胞后，其過表達可抑制Bcl-2蛋白表達，相反則升高(P<0.001)。與對照組細胞比較， miR-21抑制表達時Bcl-2蛋白表達升高(P<0.001)，過表達時Bcl-2蛋白表達降低(P<0.001)(圖3)。

A.Bcl-2 positive expression; B.Bcl-2 negative expression圖2 Bcl-2的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果Fig 2 Immunohistochemical results of Bcl-2(IHC×100)

表1 不同皮膚組織中Bcl-2蛋白的免疫組化檢測結(jié)果

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with miR-21 inhibitors圖3 miR-21對Bcl-2蛋白表達的影響Fig 3 Effect of miR-21 on Bcl-2 protein expression

3 討論

銀屑病俗稱牛皮癬，易復(fù)發(fā)，難以根治，主要特征為角質(zhì)形成細胞異常增殖和趨化因子誘導(dǎo)炎性細胞浸潤表皮。目前研究認為銀屑病是在多基因遺傳背景下發(fā)生的免疫異常疾病，發(fā)病機制復(fù)雜[3-5]。銀屑病表皮角質(zhì)異常增生，說明患者表皮角質(zhì)形成細胞周期存在異常情況[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在調(diào)控皮膚病中具有重要的作用[2]，miR-21可能參與了細胞增殖、侵襲及凋亡等多種生物學(xué)過程[7-9]。本研究前期發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損組織中miR-21表達異常[9]，那么與細胞凋亡密切相關(guān)的miR-21是否通過調(diào)控靶蛋白參與了尋常型銀屑病表皮角質(zhì)異常增生的過程？因此本研究選擇miR-21為切入點，以維吾爾族尋常型銀屑病患者作為研究對象，通過進行實時熒光定量PCR來檢測皮損處miRNA表達；并對其調(diào)控的下游靶蛋白Bcl-2進行檢測。

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明：miR-21在維吾爾族尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達比正常對照高，miR-21的過表達可能參與維吾爾族尋常型銀屑病的發(fā)病及進展過程。miR-21表達明顯上調(diào)與芯片篩選以及其他學(xué)者的研究結(jié)果[11-12]一致。miR-21的異常表達可能調(diào)控其靶蛋白共同作用參與了銀屑病的發(fā)病。本課題組通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測Bcl-2為miR-21的靶蛋白，Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡的重要調(diào)節(jié)分子，在線粒體水平?jīng)Q定細胞是否進入凋亡程序，從而在凋亡通路中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)功能[10-12]。

Bcl-2蛋白是家族成員中的抗凋亡蛋白，蛋白C末端疏水區(qū)可與細胞器的膜相連；N端跨膜區(qū)在Bcl-2抑制細胞凋亡過程中有重要作用[11-12]。Bcl-2蛋白與激活的促凋亡蛋白作用后失去了對細胞凋亡的抑制作用，導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生。本項目免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)：正常皮膚Bcl-2蛋白的陽性表達比維吾爾族尋常型銀屑病患者的高，說明銀屑病患者皮損處的Bcl-2表達被抑制，通過改變細胞凋亡參與調(diào)控銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程。銀屑病重要病理特征為角質(zhì)形成細胞異常增殖，因此本研究選擇HaCaT細胞作為轉(zhuǎn)染對象，由此觀察角質(zhì)形成細胞的變化過程。免疫印跡法檢測結(jié)果表明：miR-21過表達可減低Bcl-2蛋白表達，而miR-21抑制表達時則起到促進Bcl-2蛋白表達的作用。HaCaT細胞的變化過程提示其與在體研究結(jié)果一致，由此認為miR-21可能調(diào)控了Bcl-2蛋白，兩者共同作用調(diào)節(jié)細胞凋亡功能，最終導(dǎo)致使表皮角質(zhì)增殖異常，從而加速病程進展。