基于“骨肉不相親”理論探討絕經后骨質疏松癥的代謝組學研究

孫娜，劉瑤，徐琬梨?，劉國巖

（1.山東中醫藥大學中醫學院，山東 濟南 250014；2.山東省中醫院，山東 濟南 250014）

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種與女性生理周期相關的由雌激素戒斷引起的系統性骨骼疾病［1-2］，主要特征為骨量減少及骨的力學結構改變，后期易致畸、致殘，嚴重影響患病人群的生活質量，已成為全球性公共衛生問題之一。因此，探明PMOP的分子機制成為亟待解決的問題。近年來，越來越多的研究表明，PMOP的發生與相關基因、蛋白質等生物大分子的表達水平異常密切相關［3-8］。中醫學中雖無骨質疏松癥之名，但類似癥狀古籍多有記載，該病屬“骨痿”范疇，其中“骨肉不相親則肉軟卻……發無澤者骨先死”及“骨枯而髓減，發為骨痿”等表明骨痿病機與“骨肉不相親”密切相關。現代醫家在此基礎上結合“腎主骨”“脾主肉”理論對PMOP進行臨床研究，治療方向由腎論治轉向脾腎論治，治療效果較為顯著［9］，但“骨肉不相親”致PMOP的系統病理機制尚不明確。為了探明該病理機制，本研究擬通過檢測PMOP脾腎虧虛證患者、PMOP腎虛證患者及正常對照人群的血清差異代謝物，尋找PMOP脾腎虧虛證患者體內發生獨特改變的代謝通路及網絡，以期從代謝組學角度揭示該病病理機制的同時，為該病靶向治療提供數據支持［10-11］。

1 材料與方法

1.1 研究對象

結合證候辨證素量表，選取山東省中醫院骨科收治住院且經測定骨密度后確診的30例PMOP脾腎虧虛證患者（脾腎虧虛組）和30例PMOP腎虛證患者（腎虛組），以及18例健康人（正常組）作為研究對象。本研究共收集78例受試者的血清資料，參與本研究的人群均被明確告知血液用途。年齡、絕經年齡、身高、體質量、BMI方面的基線資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組基線資料比較（±s）

表1 各組基線資料比較（±s）

組別脾腎虧虛組腎虛組正常組例數30 30 18年齡（歲）55.22±3.56 54.83±2.98 53.65±3.87絕經年齡（歲）51.20±1.66 50.73±1.32 50.87±2.01身高（cm）154.56±4.26 153.36±3.68 154.97±3.94體質量（kg）47.45±2.30 45.79±1.96 45.92±2.60 BMI（kg/m2）19.45±2.63 20.31±3.12 19.93±3.01

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準

參照《原發性骨質疏松癥診療指南》［12］，以脆性骨折程度或DXA 骨骼密度測量結果為準，若該值≤-2.5則可確診。

1.2.2 中醫診斷標準

參照2011 版《中醫診斷學》［13］、2013 版《絕經后骨質疏松癥》［14］及《中醫藥防治原發性骨質疏松癥專家共識（2020）》［15］，共同制定本研究的中醫證型診斷標準。腎虛證：主癥為腰膝酸軟，失眠健忘；次癥為頭暈耳鳴，耳聾，發脫齒搖，性欲減退，尿有余瀝，尿失禁，尺脈沉遲，舌淡苔白，面色晦暗等。脾腎虧虛證：主癥為腰膝酸軟，倦怠乏力；次癥為四肢怠惰，大便溏薄，納呆食少，脘腹脹滿，面色?白，懈惰嗜睡，注意力不集中，苔白，脈沉細等。主癥滿足1～2 項，次癥滿足2～3 項即可確診。

1.3 納入標準

①符合上述診斷標準；②均絕經1年以上；③臨床資料相對完整；④自愿參與本研究；⑤中醫證型確診無疑義。

1.4 排除標準

①有各種影響骨代謝疾病的病史；②有血液系統疾病；③有慢性腎功能不全、惡性腫瘤病史；④有長期糖皮質激素使用史及免疫抑制劑治療史。

1.5 血清采樣方法

采集樣本前3 d，囑患者停藥以免藥物對本研究結果造成干擾。晨起對患者進行空腹靜脈取血，并于室溫下離心5 min，取上層血清，將其置于-80 ℃的冰箱中，等待檢測。

1.6 樣本預處理

室溫條件下解凍各組血清，取樣本200 μL 和400 μL 緩沖液（45 mmol/L NaH2PO4/K2HPO4；0.9%NaCl；pH 值7.4；50%D2O）置于1.5 mL 的離心管中，進行充分的混勻斡旋、震蕩。置于4 ℃環境下離心10 min，分出上層清液550μL，并置于5 mm 核磁管（Wilmad-LabGlass）中等待下一步實驗。

1.7 H-NMR數據的采集及處理

核磁共振技術（nuclear magnetic resonance，NMR）實驗中所用的儀器是Varian 600 MHz譜儀，1H共振頻率是599.93 MHz。將核磁共振管放入并進行勻場鎖場（鎖場信號為重水信號），利用自波回旋法，橫向弛豫加權實驗中，選用水峰抑制Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列，并設置25 ℃下弛豫延遲時間為2.0 s，采集時間是1.5 s，譜寬為12 000.0 Hz，總回波時長設置100 ms，累加64次。

1.8 統計學方法

采用MestReNova（V9.0.1）對H-NMR采集處理后的原始數據進行傅里葉變換、基線校正及定標處理后，對其進行多元變量模式識別分析，主要包含主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projections to latent structuresdiscriminant analysis，OPLS-DA）。對比OPLS-DA各模型中代謝物的相關系數，將每一個變量的Loading值與其標準偏差相乘后進行數據的回溯轉換，統計總結出具有統計學意義（P＜0.05）的血清差異代謝物。

2 代謝組學結果

2.1 代謝譜分析

使用SIMCA 軟件［16］（V14.1，MKS Data Analytics Solutions，Umea，Sweden）將正交變換轉換為線性不相關變量，自動建模分析后發現脾腎虧虛組、腎虛組與正常組間的代謝譜有明顯分離，解釋數據變量具備進一步研究的意義。見圖1。

2.2 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）

采用OPLS-DA 的方法對數據進行進一步處理［17］。見圖2。其中脾腎虧虛組、腎虛組樣本與正常組相比數據分離較為明顯，表明有進一步研究價值。為了進一步驗證各兩組模型是否具備可靠性和較高的預測率，對數據進行置換檢驗，得出結果R2Y、Q2值接近1。見圖3。各組間數據的OPLS-DA 載荷圖見圖4，圖中橫坐標意為化學位移，縱坐標表明載荷值。紅色為正相關，且顏色的深淺程度與相關系數成正比；藍色為負相關，顏色的深淺程度隨相關系數的增長而變淺。圖4中各標記物質在相關系數方面已通過臨界值檢驗。

2.3 差異代謝物篩選

研究OPLS-DA模型時，各個組間排列檢驗所示結果對應不同系數，分析整理得出具備統計學意義的所有組間血清差異代謝物明細。將相關系數圖中的所有變量Loading 值與其標準偏差相乘，對數據進行回溯轉換，將絕對值與0.361 比較，得組間存在的差異代謝產物。見表2。

2.4 KEGG通路分析

通過在線網站Metascape（https：//metascape.org）對表1中的差異代謝物進行KEGG 通路分析，得出相關通路及通路中包含化合物［18］。見表3。

表3 富集通路注釋信息表

2.5 差異代謝物的代謝通路分析

將表2中的差異代謝物導入在線代謝網站MetaboAnalyst（https：//www.metaboanalyst.ca）進行測算，得出代謝物相關通路，將其中影響因子＞0.05的重要通路納入分析。結果：Valine，leucine and isoleucine biosynthesis為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸合成代謝；Valine，leucine andisoleucine degradation 為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解代謝；Aminoacyl-tRNA biosynthesis為氨基酞-tRNA合成代謝；Glycolysis or Gluconeogenesis為糖酵解/糖異生；Glycerophospholipidmetabolism 為甘油磷酸代謝；Glyoxylate and dicarboxylate metabolism 為乙醛和二梭酸代謝；Methane metabolism 為甲烷代謝；Pyruvate metabolism 為丙酮酸代謝；Glyoxylate and dicarboxylate metabolism 為乙醛和二羧酸代謝；Glycerophospholipid metabolism為甘油磷酸代謝；Glycolysis or Gluconeogenesis為糖酵解/糖異生；Pentose phosphate pathway為戊糖磷酸途徑；Galactose metabolism 為半乳糖代謝；Starch and sucrose metabolism 為淀粉和蔗糖代謝；Citrate cycle（TCA cycle）為檸檬酸循環（TCA循環）。見圖5。

表2 脾腎虧虛組、腎虛組與正常組間的差異代謝物

3 討論

“骨肉不相親”理論相關記載最早見于《靈樞·經脈》，如“骨不濡則肉不能著也，骨肉不相親則肉軟卻”，《靈樞·癲狂》及《素問·生氣通天論》中亦有相關表述，如“骨正筋柔，氣血以流，腠理以密，如是則骨氣以精”，高度概括了骨與肉之間的內在平衡關系，是中醫學對肌骨協同病變病理機制的系統性總結。現代醫學證明骨與肌肉共同起源于軸旁中胚層，在解剖位置中相互依存，且各自作為內分泌器官，通過分泌激動因子、骨因子及代謝產物等共同參與包括PMOP 在內的增齡性肌骨疾病病理過程［19-21］，這與中醫學骨肉關系及骨肉協同致病理論具有一致性。除此之外，通過骨應力生物力學機制探查骨、肌肉與PMOP 之間的聯系也取得了一定成果，如骨細胞感受應力刺激信號后可產生骨鈣素等因子調控骨穩態平衡及骨骼肌強度［22］，據此認為適宜強度的應力刺激有利于改善PMOP 等增齡性肌骨疾病的癥狀。相關研究表明，骨功能下降時，肌肉的力量及功能亦得不到很好的發揮，影響機體的平衡能力及穩定性，進一步證明骨、肌肉功能異常可以導致PMOP的發生［23］。

《類經》中“脾主肌肉故脾絕則肉先死，腎主骨故腎絕則骨先死”及“治痿獨取陽明”將“骨肉不相親”理論從肌骨關系深化到脾腎生克制化。腎為先天之本，主骨生髓，女子絕經后天癸消失，腎精虧損嚴重，“尺濡則骨肉不相親”表明腎精虧虛易發為骨痿。此時，先天之精不能對后天之精產生足夠的滋養作用，后天之精的化生之源脾胃發生虧虛，后天之精充養先天之精的功能不足以發揮，久之脾腎皆虛，促進“骨痿”的產生。現代醫學研究中，運用補腎健脾法治療骨質疏松癥取得了一定進展，如用補中益氣丸聯合補中益氣湯可以提高絕經后骨質疏松癥患者的雌激素水平及調節免疫炎癥反應等，與中醫脾腎皆虛致骨痿理論有一致性［24-26］，但脾腎虧虛致骨痿的系統病理機制目前仍不明確，需進一步研究探索。

現代研究中，通過代謝組學方法探討脾腎虧虛型PMOP的有效治療方式取得了一定進展［27］，本研究在此基礎上，擬通過探查脾腎虧虛型PMOP患者血清中的特異代謝產物及其影響的代謝通路，為闡明脾腎虧虛致PMOP 的系統病理機制提供數據支持。本研究采取代謝組學方法，發現PMOP腎虛組患者血清中差異代謝物包括乙醇胺、甲酸、異丁酸、異亮氨酸、丙二酸鹽、亮氨酸、低密度脂蛋白、丙二酸鹽、α-葡萄糖及β-葡萄糖；發生改變的通路主要包括蛋白質消化和吸收，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，碳代謝，氨酰tRNA 生物合成，2-氧代羰基酸代謝，ABC 轉運蛋白，礦物吸收，癌癥中心碳代謝以及糖酵解/糖異生。對比腎虛組數據，認為PMOP 脾腎虧虛組特有的血清差異物為甘油和丙酮酸，發生改變通路包括戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化、乙醛酸和二羧酸代謝、戊糖磷酸途徑、丙酮酸代謝及半乳糖代謝。

糖酵解第一階段過程中，半乳糖代謝產生的D-葡萄糖在已糖激酶、葡萄糖激酶的作用下，分子結構中的碳氫鍵斷裂釋放能量，生成的磷酸果糖參與戊糖磷酸途徑；第二階段過程中D-葡萄糖在破骨細胞肌動蛋白環附近丙酮酸激酶等一系列酶的催化下最終轉化為丙酮酸，經歷丙酮酸代謝、輔酶A合成等調控骨降解能量途徑［28］，這可能是脾腎虧虛組患者血清差異物丙酮酸影響PMOP 發生的體內途徑。甘油酯代謝途徑的初始化合物3-磷酸甘油酸既可以來自糖酵解過程，也可以源于甘油，而半乳糖代謝中D-半乳糖可以在α-半乳糖苷酶的催化下生成甘油。甘油參與脂質代謝并產生重要能量物質-脂肪酸、甘氨酸和膽固醇，血液中游離脂肪酸含量增加時可以影響過氧化物酶體增殖激活受體（peroxisome proliferation activates the receptor，PPAR）的表達［29］。該受體中的PPARα和PPARδ對破骨細胞的生成和骨吸收具有抑制作用，而PPARγ 有利于加速破骨細胞的生成進程，PPARα、PPARδ和PPARγ共同參與三羧酸循環促進破骨細胞的分化，加速骨質流失，發為PMOP［30-35］，這可能是脾腎虧虛組患者血清差異物甘油影響PMOP 發生的體內機制。本研究中PMOP 脾腎虧虛組患者血清內的甘油含量增加，表示與甘油相關的脂質代謝發生紊亂，相關研究也支持這一結論［34］。

作為與衰老明確相關的代謝途徑［36］，丙酮酸代謝中丙酮酸可以在甲酸-C-乙酰轉移酶的作用下生成甲酸參與乙醛酸和二羧酸代謝途徑，也可以經由丙酮酸脫氫酶、乙酰轉移酶催化后生成2-氧戊二酸鹽繼而轉化成乙酰輔酶A參與三羧酸循環。三羧酸循環途徑作為體內三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成的重要來源之一，對調控機體的能量代謝平衡具有重要意義，與能量代謝密切相關，由此可見PMOP脾腎虧虛組患者丙酮酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝途徑改變，意味著能量代謝異常。PMOP本質為骨吸收大于骨生成，而骨吸收活性增強過程中需要消耗大量的ATP，結合研究過程中與能量代謝相關的戊糖磷酸途徑產生異常，認為PMOP 脾腎虧虛組患者在破骨細胞能量代謝方面存在異常。有研究認為破骨細胞的骨吸收強烈依賴于能量消耗，亦一定程度上支持本結論［23］。

戊糖磷酸途徑中，葡萄糖可在葡萄糖酸內酯酶、葡萄糖酸脫水酶的作用下轉化為丙酮酸，經甘油酸酯分解后參與糖酵解過程。戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化過程中，半乳糖醛酸酯在D-半乳糖醛酸還原酶等一系列還原酶的催化作用下生成甘油，參與脂質代謝。乙醛酸和二羧酸鹽代謝過程中產生的丙酮酸參與甘氨酸、絲氨酸及蘇氨酸代謝途徑時，產生的代謝產物羥基丙酮酸在某些條件下可以進一步生成ATP［37］及L-谷氨酰胺，其中L-谷氨酰胺消耗時可抑制破骨細胞的分化和表達［23］，進而實現對PMOP 的調控作用，一定程度上增加本研究結果的可信度。

基于以上數據，本研究認為PMOP 是一種以能量代謝、脂質代謝紊亂為特征的慢性代謝疾病，相關研究亦得出相同結論，一定程度上為本研究增加可信度［38-39］。本研究中的PMOP 脾腎虧虛組中甘油含量及相關脂質代謝途徑異常表明患者出現脂代謝紊亂，結合“骨肉不相親”理論，中醫中“肉”的廣義概念不局限指代肌肉，還包括脂肪，故下一步研究將增加脂肪相關的觀察指標，完善“骨肉不相親”理論下的骨肉關聯內容，以期從分子生物學方面為探索PMOP 的發病機制提供方向，更好地指導臨床。