紫連膏家兔皮膚重復給藥4周毒性研究

楊宏博，葉建州，梅晶，袁芳，劉明超，劉紅斌，李勇，師廷川，王京昆?

（1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2.云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室，云南 昆明 650111；3.云南省中醫醫院，云南 昆明 650111）

紫連膏（Zilian Cream）又名黃金萬紅膏，是云南省中醫醫院臨床應用30 多年的經驗方，由紫草、黃連、生地黃、當歸、黃芩、虎杖、生地榆、冰片等中藥及基質（白凡士林）組成，方中紫草清熱解毒、生肌斂瘡，入血分，可升可降；黃連清熱燥濕、瀉火解毒，質堅味厚，降而微升；生地黃清熱涼血、養陰生津，三者共為君藥。黃芩清熱燥濕、瀉火解毒；生地榆涼血止血，助君藥加強清熱解毒、斂瘡止痛之功，為臣藥。當歸補血活血，虎杖活血散瘀、解毒消腫，為佐藥。冰片善通諸竅、散郁火、辟穢濁，清熱消毒止痛為使藥。全方共奏清熱解毒、涼血消斑、活血止痛、祛腐生肌、燥濕收斂之功效［1］。該藥作為云南省中醫醫院的院內制劑已獲批準［批準文號：滇藥制字（Z）20082571A］，其膏呈紫紅色，均勻細膩，主要用于治療燙傷、燒傷、銀屑病、嬰兒尿布皮炎（嬰兒紅臀）等屬熱毒內盛者［2-3］。

目前，關于紫連膏研究多集中在臨床療效和適應證上，如耳廓濕疹［4］、糖尿病足皮膚病［5］、Ⅱ期壓瘡［1］、張力性水皰［6］等，而對其臨床使用是否具有毒性作用（副反應）以及其嚴重程度的研究尚不深入，目前文獻中還未見其相關報道。在研究完成紫連膏經皮膚單次給藥毒性的基礎上，本課題組在通過國家認證的GLP條件下，進一步對其經完整皮膚重復給藥4 周的慢性毒性進行研究，通過研究了解受試物在家兔體內可能產生的毒性作用特點及可逆性、延遲毒性等特征，分析判斷其可能的毒性靶器官/靶組織，從而為臨床用藥安全及不良反應監測提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

電子天平（美國雙杰兄弟集團有限公司常熟市雙杰測試儀器廠，型號：TC-30K）；血液分析儀（Siemens Healthcare Diagnoseics.Inc，型號：ADVIA 2120）；凝血分析儀（DIAGNOSTICA STAGO.Inc，型號：STA Compact）；全自動生化分析儀（Beckman Coulter.Inc，型號：Unicel DxC600）；十六道生理信號采集分析系統（美國BIOPAC 公司，型號：MP150）；生物顯微鏡（廣州市明美光電技術有限公司，型號：ML31）；病理切片掃描系統（寧波江豐生物信息技術有限公司，型號：KFPRO-005）；動物麻醉機（上海任誼生物科技有限公司，型號：MSS-4S）。

1.2 藥物及試劑

紫連膏（云南省中醫醫院，批號：20200604，20 g/盒，含量：每1.0 g 相當于飲片0.3 g，按滇ZJGF-396-2019 標準檢測，符合標準要求）；白凡士林（江西益普生藥業有限公司，批號：20200901）；異氟烷（天津普瑞生物藥業有限公司，批號：20191201）。

1.3 實驗動物

普通級新西蘭家兔40只，4～5月齡，雌雄各半，體質量2.5～3.5 kg，購于山東艾萊克生物科技有限公司，許可證號：SCXK（魯）20190006，質量合格證編號：370839210100001742。全部家兔飼養于通過國家GLP認證的普通環境動物實驗室內，采用50 cm×40 cm×40 cm（長×寬×高）不銹鋼干養式實驗籠單籠飼養，每日每只家兔投放80 g兔生長繁殖飼料，自由攝食飲水。溫度16～26 ℃（最大日溫差≤4 ℃），濕度40%～70%，換氣次數≥8 次/h，氣流速度≤0.2 m/s，氨濃度（動態）≤14 mg/m，光照12 h/12 h明暗交替，動物照度100～200 lx，工作照度≥200 lx，噪聲≤60 dB；直徑90 mm 平皿敞開放置0.5 h，置37 ℃溫箱培養48 h，≤30個/皿。

試驗動物使用過程均符合動物福利要求，并通過實驗動物管理和使用委員會（IACUC）的審查批準，審查編號：動（倫）IACUC-2021-003-01。

2 方法

2.1 對照品的選擇

白凡士林作為紫連膏制劑唯一的基質成分，因其具有良好的防水性，對任何類型的皮膚都沒有刺激性［7］，是一種非常好的保濕用品，同時作為藥用及化妝品輔料，廣泛用于制備藥膏、皮膚保護油膏、化妝品乳膏、香脂化妝油等［8］，故本研究僅以市售白凡士林作為輔料對照，不再單獨設陰性對照。

2.2 動物分組

參照國家食品藥品監督管理總局制定的《藥物非臨床研究質量管理規范》和《藥物重復給藥毒性研究技術指導原則》要求，選擇一般健康狀況及去毛處皮膚情況良好的成年新西蘭家兔40 只，用Excel 進行隨機區組設計法將家兔分為4 組，即輔料對照組和紫連膏低、中、高劑量組，各組動物體質量差異均不超過單性別動物平均體質量的20%，每組10 只，雌雄各半。

2.3 劑量設置及依據

依據紫連膏說明書的用法、用量，用于燒傷、燙傷和銀屑病，每天最大用量為0.1 g/cm2，每天2 次，間隔8 h。其中，治療燒傷、燙傷使用2 周，治療銀屑病使用3周。課題組以往已經完成了家兔每次以50.0 mg/cm2劑量于10%體表面積的背部皮膚涂擦紫連膏，24 h內涂擦3次，每次間隔（4.0±0.5）h的單次毒性試驗實驗，以及家兔每次以50.0 mg/cm2劑量于10%體表面積的背部皮膚涂擦紫連膏，24 h 內涂擦2 次，每次間隔（4.0±0.5）h的重復給藥7 d毒性試驗。

兩個試驗研究結果表明，紫連膏對完整皮膚家兔均未表現出明顯的毒性反應作用。因此，為充分暴露受試物的毒性，盡可能獲得受試物的最大劑量下的毒性信息，依據國家食品藥品監督管理總局制定的《化妝品安全技術規范》，在本研究中紫連膏低、中、高3個劑量組均于動物最大可給予的10%體表面積［9］，每次分別以15.0、32.5、50.0 mg/cm2單位面積劑量涂擦紫連膏，24 h 內給予2 次。輔料對照組給予與紫連膏高劑量組面積、容積及次數相同的白凡士林。給藥面積以5 cm2作為動物給藥的最小精度面積，給藥面積計算方法見公式（1）［10］。劑量設置情況具體見表1。

表1 各組劑量設置情況

其中，A為體表面積（m2），W為體質量（kg），K為體型系數（家兔為0.101 4）。

2.4 動物去毛

使用電推剪緊貼皮膚直接去除動物背毛。動物分組前進行首次去毛，去毛面積較大于給藥面積，從而保證為覆蓋物預留足夠的固定面積。給藥期及恢復期每周去毛1～2 次，具體依據是否影響給藥及局部皮膚刺激性觀察而定。

2.5 動物給藥

于首次給藥前以及給藥后每個周期（7 d）的固定時間稱量動物體質量，以此計算下一周期動物的給藥量，期間內給藥劑量不變。每次給藥前準確稱量藥物，均勻緩慢涂擦于相應給藥面積的去毛背部皮膚上，隨后用空白膏藥貼覆蓋，固定給藥部位，并同時用脖圈固定動物頭部，保證樣品與皮膚充分接觸。各組動物每天給藥2 次，每次藥物停留時間（4.0 ± 0.5）h，結束后取下脖圈，使用醫用干棉球反復輕擦去除受試物，至擦除干凈為止。按以上操作，連續給藥4周［11］。

2.6 指標檢測方法和頻率

2.6.1 一般臨床癥狀、體征以及給藥局部刺激性

給藥前，每天觀察動物一般癥狀、體征1 次。給藥期間，每次給藥后立即連續觀察動物反應1 h，并在擦除受試物0.5 h 后至下一次給藥前，觀察給藥局部皮膚刺激反應情況。恢復期間，每天觀察動物一般癥狀、體征以及給藥局部刺激性反應情況2 次，連續4 周。觀察內容包括家兔外觀、行為、分泌物、排泄物、給藥局部情況、死亡情況及中毒反應癥狀及其起始時間、嚴重程度、持續時間、是否可逆及恢復時間等。具體如下：

①外觀、體征情況：口、眼、鼻分泌物（顏色），角弓反張、驚跳反射，皮膚、黏膜潮紅（部位），呃逆、流涎（顏色、質地），紅斑、丘疹（部位），紫紺（部位），瘙癢、腫脹（部位），尿液和糞便的變化（顏色、性狀），豎毛、昏迷、休克，大、小便失禁，死亡等；

②行為、活動狀況：俯臥、運動失調、步態不穩、活動減少、無法站立、抽搐、驚厥、角弓反張、震顫、麻痹、劇烈掙扎、反抗尖叫等；

③精神狀態：興奮、煩躁、困倦、萎靡等；

④呼吸情況：呼吸困難、呼吸暫停、呼吸急促、喘息、腹式呼吸等；

⑤給藥局部情況：給藥部位皮膚情況、有無刺激反應等，主要包括局部皮膚有無紅斑、水腫、結痂等。具體參照皮膚刺激性試驗中“皮膚刺激反應評分標準”和“皮膚刺激強度評價標準”［12-13］對動物給藥局部反應情況進行評價。

計算方法見公式（2），情況見表2、表3。

表2 皮膚刺激反應評分標準

表3 皮膚刺激強度評價標準

其中，M平為每組動物每次刺激反應的平均積分；A為總積分，即組內每只動物每次各皮膚刺激反應評分之和；n為組內動物只數。

2.6.2 攝食量

各組動物按A、B、C三級半定量法進行評價。A級：全部吃完或僅剩少量食物；B 級：剩余1/3～1/2 食物；C級：未吃或僅吃少量食物。試驗期間，每天上午喂飼前評價1次，并在每一個周期（7 d）進行1次總評價。

2.6.3 體質量

給藥前、給藥期和恢復期間，每周固定時間稱重1次。

2.6.4 體溫

獸用體溫計測量動物肛溫，給藥前測量1 次，給藥期和恢復期的第2、4周各測量1次。

2.6.5 心電（ECGⅡ）

給藥前、給藥期第4 周和恢復期第4 周各檢測1 次。ECGⅡ指標包括：P 波振幅（mV）、ST 偏移量（mV）、R波振幅（mV）、T波振幅（mV）、心率（HR，次/min）和RR間期（s）。

2.6.6 血常規及血清生化、電解質

給藥前、給藥期第4周及恢復期第4周分別采集家兔耳中央動脈血液，每次采血動物需提前禁食不禁水12～15 h，待確定所有動物血樣滿足檢測要求后再進行喂飼。具體檢測內容包括：

①血液學指標：用EDTA-K2管采集血液樣本2.0 mL，分別測定血紅蛋白（HGB）、平均紅細胞血紅蛋白（MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）。

②凝血指標：用檸檬酸鈉管采集血樣2.0 mL，分別測定凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）。

③血清生化及電解質指標：用全血管采集全血3.0～5.0 mL，分別測定γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）、甘油三酯（TG）、血糖（GLU）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸磷酸激酶（CK）、肌酐（CREA）。

2.6.7 系統解剖和肉眼觀察

4 周給藥結束后，各組動物自第1 只開始，間隔選擇處死3 只，共12 只。4 周恢復期結束后，處死剩余全部動物。各動物在解剖前需禁食不禁水12～15 h，按解剖順序吸入異氟烷麻醉，待動物達到深度麻醉后，大腿雙側股動脈放血處死。解剖時，肉眼觀察家兔外觀、毛色、給藥局部皮膚、外生殖器等有無異常，臟器有無病變。再按由上至下，從外到內的順序分別摘取動物各臟器和解剖前大體觀察時發現的異常組織、腫塊等。臟器摘取后，除眼（連帶哈氏腺）用改良Davidson's 液固定、睪丸及附睪用Bouin 液固定外，其余各臟器、組織置于10%中性緩沖福爾馬林液中固定，以備后續切片、HE染色和組織病理學檢查。

2.6.8 臟器重量、系數及臟腦比

解剖后，分別稱取腦、心、肝、脾、肺臟、左腎、右腎、腎上腺（雙側）、胸腺、左睪丸、右睪丸、附睪（雙側）、子宮、卵巢及輸卵管的重量，并計算腎臟（左腎+右腎）、睪丸（左睪丸+右睪丸）的重量和臟器系數，若臟器系數組間比較有顯著性差異或有明顯改變，則需進一步計算臟器與腦重比值。

2.6.9 骨髓象檢查

摘取家兔胸骨，制作骨髓標本，對骨髓細胞指標進行計數檢查。具體檢查指標如下：

①粒細胞系統：原始粒、早幼粒、中性粒（中幼、晚幼、桿狀、分葉核）、嗜酸性粒（中幼、晚幼、桿狀、分葉）和嗜堿性粒（中幼、晚幼、桿狀、分葉）；

②紅細胞系統：原始紅、早幼紅、中幼紅和晚幼紅；③其他：淋巴細胞、單核細胞、漿細胞、巨核細胞、增生程度、粒細胞系統/有核紅以及細胞形態。

2.7 數據統計處理方法

采用SPSS 24.0統計軟件進行數據統計分析。計量數據組間比較時，正態分布、方差齊性檢驗結果顯著（P＞0.05）的數據，采用LSD檢驗，非正態分布或方差不齊的數據以及加權后的半定量指標均采用非參數檢驗（即Nonparametric Test 中的K-independent samples 進行Kruskal～Wallis H檢驗），以P＜0.05代表差異具有統計學意義。恢復期各組動物樣本數量較少（♀/♂：2/2），故在統計時僅計算平均值及標準差，不進行顯著性差異分析。

3 結果

3.1 各組家兔一般癥狀、體征情況

在給藥及恢復期間觀察可見，輔料對照組及紫連膏低、中、高劑量組各動物皮毛光澤、行為活動、精神狀態、呼吸情況等均無異常，一般狀況良好，由此表明紫連膏對家兔一般癥狀、體征無明顯影響。

3.2 各組家兔給藥局部皮膚刺激性癥狀比較

給藥期間，輔料對照組各動物給藥部位皮膚一般狀況良好，無紅斑、水腫等局部皮膚刺激性反應癥狀。紫連膏高劑量組個別動物在給藥第4 周出現輕度水腫皮膚刺激反應癥狀。從觀察到紅斑或/和水腫刺激反應癥狀的動物數量和嚴重程度上看，紫連膏的皮膚刺激性具有隨著劑量增加和給藥時間持續而隨之增加的趨勢。停藥恢復期，出現紅斑或/和水腫刺激反應的動物癥狀逐漸減輕，恢復正常。同時，從皮膚刺激反應評分統計結果可見，紫連膏高劑量組最高平均積分為0.90，處于輕度刺激性（0.5～2.99）的標準范圍內。由此可見，紫連膏高劑量對家兔完整皮膚表現出輕度刺激性。因恢復期剩余動物局部皮膚刺激性反應癥狀評價的平均積分，不能代表各組動物皮膚刺激性反應的整體情況，故以總積分表示。見表4。

表4 各組家兔給藥局部皮膚刺激性反應癥狀積分比較

3.3 各組家兔攝食量評價

給藥前、給藥期及恢復期間，各組動物攝食正常，可見紫連膏對家兔的攝食量無明顯影響。

3.4 各組家兔體質量及增長幅度比較

給藥前飼養期，紫連膏低、中、高劑量組動物平均體質量均有明顯增加，表明動物處于正常生長狀態。給藥期間，紫連膏各劑量組動物平均體質量呈現先降后升的狀態，其增長幅度均以給藥后第1 周下降最為明顯，至給藥第4 周結束，各組動物平均體質量及增長幅度均明顯增加。恢復期，各動物體質量生長正常。與輔料對照組比較，給藥第4 周時紫連膏低、中劑量組增長幅度明顯更高（P＜0.01），其原因主要是由于動物對給藥方式的應激反應所致，之后隨著給藥時間的不斷增加，動物逐漸適應，應激反應逐漸消失。因此可以認為紫連膏對家兔體質量無明顯影響。見圖1。

3.5 各組家兔體溫情況比較

紫連膏各劑量組給藥前、給藥期以及恢復期間，每只家兔的體溫實測值及其平均值均在正常體溫范圍（38.0～39.8 ℃）［14-15］內波動，其中給藥第2周時，以輔料對照料組和紫連膏高劑量組下降較為明顯，近于正常體溫下限38.0 ℃。與輔料對照組比較，紫連膏低、中劑量組體溫明顯更高（P＜0.01）。出現該波動變化的原因推測為與給藥容量相關，隨著給藥容量的增加，動物的應激反應隨之增加，使體溫出現明顯下降，隨著給藥時間的持續，動物逐漸產生適應性，自身對體溫調節作用增強，因此在給藥期結束時，家兔體溫接近給藥前，恢復期結束時與給藥前持平。在給藥期結束時，各組平均體溫均有所升高，恢復期間與給藥前基本一致，因此可以認為紫連膏對家兔體溫無明顯影響。見圖2。

3.6 各組家兔心電（ECG Ⅱ）指標比較

給藥4周和恢復4周結束，紫連膏低、中、高劑量組ECG Ⅱ以振幅相關指標及RR 間期、心率（HR）指標波動較為明顯，但從統計結果上看，各指標均無明顯劑量-反應的規律性變化趨勢。與輔料對照組比較，紫連膏低、中劑量組ST 偏移量明顯偏低（P ＜0.05，P ＜0.01），但未見明顯的異常ST 段正向或負向偏移和特征性形態學變化，因此認為產生以上明顯波動變化的指標應與動物自身的生理波動直接相關，而與藥物無明顯相關性。由此可見紫連膏對家兔ECG Ⅱ各指標無明顯影響。見表5。

表5 各組家兔心電指標比較（±s）

表5 各組家兔心電指標比較（±s）

注：與輔料對照組比較，★P ＜0.05，★★P ＜0.01。

組別輔料對照組紫連膏低劑量組紫連膏中劑量組紫連膏高劑量組心率（HR）（次/min）201.9±50.2 260.8±35.7 199.7±34.5 220.1±31.1 255.5±40.8 216.5±23.5 249.2±47.0 274.6±26.4 289.8±6.5 244.6±42.7 261.6±40.0 264.9±20.0時間給藥前給藥期第4周恢復期第4周給藥前給藥期第4周恢復期第4周給藥前給藥期第4周恢復期第4周給藥前給藥期第4周恢復期第4周例數10 10 4 10 10 4 10 10 4 10 10 4 P波振幅（mV）0.061±0.026 0.102±0.046 0.075±0.039 0.085±0.034 0.090±0.021 0.089±0.027 0.088±0.033 0.086±0.041 0.188±0.054 0.086±0.035 0.133±0.050 0.133±0.038 R波振幅（mV）0.234±0.130 0.363±0.214 0.291±0.196 0.287±0.151 0.339±0.149 0.321±0.149 0.348±0.134 0.369±0.188 0.298±0.126 0.302±0.198 0.305±0.085 0.261±0.055 T波振幅（mV）0.126±0.027 0.185±0.068 0.187±0.080 0.157±0.061 0.177±0.040 0.185±0.051 0.193±0.070 0.164±0.096 0.278±0.039 0.188±0.104 0.203±0.060 0.222±0.040 ST偏移量（mV）0.040±0.020 0.068±0.029 0.056±0.039 0.038±0.017 0.045±0.019★0.064±0.018 0.055±0.028 0.038±0.025★★0.077±0.010 0.053±0.035 0.061±0.023 0.088±0.039 RR間期（s）0.315±0.076 0.235±0.040 0.308±0.055 0.278±0.046 0.240±0.038 0.280±0.031 0.249±0.050 0.220±0.020 0.207±0.004 0.256±0.062 0.236±0.048 0.228±0.018

3.7 各組家兔血液學及凝血指標比較

給藥第4周，紫連膏低、中、高劑量組的PT和APTT指標表現出相對明顯的升高/下降趨勢變化，且具有明顯的劑量-反應趨勢。與輔料對照組比較，紫連膏高劑量組PT明顯升高（P＜0.01）；紫連膏中劑量組MCHC明顯下降（P＜0.01），但無明顯劑量-反應的規律性變化趨勢，且在其相關的HGB、MCH指標中也未見相應的變化趨勢，因此推測MCHC指標在紫連膏中劑量組中產生的顯著性差異存在一定的偶然性，雖有統計學意義，但可認為無明顯的生理學意義。恢復期間，紫連膏各劑量組指標也未見明顯異常變化。綜合上述結果認為，紫連膏對家兔PT和APTT凝血指標可能存在一定的影響，且具有一定的劑量-反應關系。見表6。

表6 各組家兔血液學及凝血指標比較（±s）

表6 各組家兔血液學及凝血指標比較（±s）

注：與輔料對照組比較，★P ＜0.05，★★P ＜0.01。

APTT（s）57.44±23.45 52.49±10.74 54.53±12.02 57.16±14.08 47.42±7.65 69.40±11.66 65.36±13.14 45.28±9.28 56.68±10.00 61.12±28.70 40.15±10.76★60.98±8.18組別輔料對照組紫連膏低劑量組紫連膏中劑量組紫連膏高劑量組時間給藥前給藥期第4周恢復期第4周給藥前給藥期第4周恢復期第4周給藥前給藥期第4周恢復期第4周給藥前給藥期第4周恢復期第4周例數10 10 4 10 10 4 10 10 4 10 10 4 HGB（g/L）126.0±12.0 118.3±18.4 127.5±5.5 126.9±10.9 126.6±9.8 125.8±9.1 135.2±13.4 117.8±9.1 124.5±3.7 131.5±14.8 120.6±12.2 121.8±14.1 MCH（pg）19.93±0.98 19.40±1.07 21.43±1.27 19.97±1.47 19.54±1.60 20.10±1.62 19.80±1.39 19.29±1.37 21.75±0.64 20.72±0.87 20.36±0.83 20.50±1.29 MCHC（g/L）306.0±14.4 315.8±8.4 330.0±8.0 309.7±14.2 316.7±5.4 327.0±12.4 311.5±11.4 306.4±8.7★★322.3±6.7 316.6±10.8 316.3±7.1 319.8±9.0 PT（s）7.58±0.37 7.23±0.43 7.58±0.13 7.66±0.22 7.27±0.36 7.38±0.13 7.59±0.28 7.54±0.42 7.38±0.13 7.96±0.67 7.79±0.28★★7.45±0.25

3.8 各組家兔血清生化及電解質指標比較

給藥第4 周，紫連膏低、中、高劑量組的GGT、CK和LDH指標明顯下降，TG、CREA、GLU指標明顯升高。與輔料對照組比較，紫連膏高劑量組的GLU 明顯升高，LDH 明顯下降（P＜0.05），且具有明顯的劑量-反應關系，因此認為紫連膏對GLU 和LDH 指標可能有一定影響，且以高劑量組較為明顯。見表8。

3.9 各組家兔骨髓象情況

給藥和恢復期結束后，紫連膏低、中、高劑量組動物有核細胞增生活躍，粒細胞系統、紅細胞系統以及其他細胞形態及計數均無明顯異常，表明紫連膏對家兔骨髓細胞增生及分化無明顯影響。

3.10 各組家兔系統解剖觀察情況

給藥及恢復期結束后解剖，除肉眼可見部分動物胸腺及睪丸、附睪外形體積偏小外，各動物臟器無其他明顯異常。從出現臟器異常的數量和性別差異上看，各劑量組間無明顯的劑量-反應趨勢和性別-反應趨勢，且與輔料對照組亦無明顯差異，結合組織病理學檢查結果，綜合分析認為上述異常臟器應為動物本身自發病變或生理改變所致，非藥物對動物產生的影響。

3.11 各組家兔臟器重量和臟器系數情況

給藥結束后，紫連膏各劑量組動物胸腺、子宮、附睪（總）、左睪丸、右睪丸和睪丸（總）臟器重量及系數均表現出相對較大的波動變化，但無明顯的規律性。結合組織病理學檢查結果，綜合判斷認為該臟器重量及系數的波動變化應屬于動物自身原因所致，與藥物影響無明顯相關性。因此認為紫連膏對家兔各臟器重量和系數無明顯影響。

3.12 各組家兔組織病理學檢查

給藥及恢復期結束后，紫連膏各劑量組有個別動物出現腎小管壞死、間質炎細胞浸潤，肝細胞空泡變性、肝細胞小灶狀壞死，睪丸生精小管上皮空泡變性、生精細胞層次不全，附睪內未見成熟精子，以及給藥部位棘細胞層增厚和真皮層炎細胞浸潤組織病理改變，且在給藥結束后，組織病理學檢查發現個別動物出現胸腺萎縮和給藥部位皮下肉芽組織形成的病理改變。上述鏡檢結果與解剖時肉眼觀察的異常臟器結果具有完全對應關系。分析以上病變產生的原因，主要與動物自發性病變（腎臟、肝臟、睪丸和附睪）、年齡/健康狀態（胸腺）和反復涂擦操作物理刺激（棘細胞層增厚和皮層炎細胞浸潤）直接相關。病變檢查結果見圖3。從各劑量觀察到的病變程度和發生比例結果可見，組間無明顯的劑量-反應趨勢，與輔料對照組比較，紫連膏各劑量組給藥后病變結果差異也無統計學意義（P＞0.05），可見紫連膏對家兔的各組織器官無明顯影響。

表7 各組家兔血清生化及電解質指標比較（±s）

表7 各組家兔血清生化及電解質指標比較（±s）

注：與輔料對照組比較，★P ＜0.05。

組別輔料對照組紫連膏低劑量組紫連膏中劑量組紫連膏高劑量組LDH（IU/L）226.0±135.8 219.5±124.9 91.5±44.3 189.2±124.9 180.6±72.4 105.3±40.3 213.7±176.9 150.7±96.2 86.8±46.9 191.6±135.5 103.4±57.6★94.5±46.3時間給藥前給藥期第4周恢復期第4周給藥前給藥期第4周恢復期第4周給藥前給藥期第4周恢復期第4周給藥前給藥期第4周恢復期第4周例數10 10 4 10 10 4 10 10 4 10 10 4 GGT（IU/L）7.8±3.2 12.7±8.2 8.8±3.5 6.9±1.4 8.2±4.7 6.8±1.3 7.0±2.3 8.6±2.5 8.0±2.9 6.1±1.9 7.7±2.1 8.0±2.9 TG（mmol/L）1.104±0.839 0.580±0.293 0.553±0.288 0.769±0.409 0.760±0.361 0.770±0.144 0.814±0.486 0.837±0.398 0.703±0.528 0.970±0.665 0.658±0.317 0.970±0.679 CREA（μmol/L）106.38±11.26 66.96±15.97 80.15±13.36 103.87±15.96 82.15±22.54 82.93±10.56 103.44±10.28 69.45±15.76 79.50±16.60 101.71±19.92 69.52±8.80 75.95±7.36 GLU（mmol/L）6.634±1.120 5.920±1.068 6.373±0.284 6.379±0.749 5.336±0.588 6.183±0.135 6.428±0.964 6.362±1.387 7.835±1.111 6.096±0.623 6.689±0.762★6.265±0.785 CK（IU/L）1 826.5±1 511.7 2 923.1±2 601.1 998.0±1 119.4 1 700.4±1 646.8 2 493.4±2 336.5 1 209.5±573.8 1 163.4±869.2 1 753.4±1 672.7 1 189.8±1 242.8 1 685.3±1 625.7 1 808.6±3 557.6 926.0±472.7

4 討論

紫連膏組方科學精妙，制劑工藝簡單可靠，用于治療燒傷、燙傷和銀屑病等皮膚性疾病，療效顯著。本研究依據《藥物重復給藥毒性研究技術指導原則》進行試驗設計，給藥采用與臨床擬用途徑一致的外用涂擦方式，實驗系統選擇體型小、性情溫和、易于馴化捉取、皮膚較薄且敏感、背景資料豐富、來源充足的家兔作為研究對象［16-17］，并以臨床上治愈燒傷、燙傷的擬用周期2周為依據，設置重復給藥周期4周。

在劑量設計上，重復給藥毒性試驗原則上至少應設低、中、高3 個劑量組，以及1 個溶媒（或輔料）對照組；原則上要求高劑量使動物產生明顯的毒性反應，低劑量等于或高于動物藥效劑量或臨床使用劑量的等效劑量，中劑量應結合毒性作用機制和特點在高劑量和低劑量之間設立，以考察毒性的劑量-反應關系［18］。結合開展完成的以50.0 mg/cm2最大單位面積劑量的皮膚單次毒性和重復給藥7 d 毒性試驗無明顯毒性反應的研究結果，綜合考慮本重復皮膚給藥毒性試驗設置，以50.0 mg/cm2作為每次皮膚涂擦給藥的高劑量，以臨床擬使用的15.0 mg/cm2劑量作為低劑量，并選擇處于低、高劑量之間的32.5 mg/cm2作為中劑量。

在研究過程中，通過觀察一般癥狀、體征，評價攝食量，測量體質量、體溫、ECGⅡ、臟器重量，計算臟器系數，檢查血常規、血清生化及電解質、骨髓象，以及解剖后的組織病理學等方法手段，考察紫連膏對完整皮膚家兔可能產生的毒性反應情況，并將局部毒性安全性評價中的藥物刺激性試驗整合其中［19-21］，一并進行考察。結果表明，與輔料對照組比較，可見PT 和GLU（紫連膏中、高劑量組）明顯升高，APTT 和LDH 明顯下降，且表現出一定的劑量-反應關系。其中，紫連膏高劑量組的GLU 和LDH 比較，具有統計學意義（P＜0.05），PT具有極顯著統計學意義（P＜0.01）。

關于家兔給藥部位的刺激性，從局部皮膚刺激反應觀察結果可見，紫連膏各給藥組家兔皮膚均觀察到紅斑，紫連膏高劑量組甚至有水腫出現，利用“皮膚刺激反應評分標準”和“皮膚刺激強度評價標準”對動物給藥局部刺激反應情況進行評價，認為紫連膏高劑量組涂擦部位皮膚達到輕度刺激性的標準。通過組織病理學檢查結果可見，各劑量組給藥部位皮膚不同幾率地出現真皮層炎細胞浸潤和棘細胞層增厚的病理改變，病變程度及發生比例無明顯規律，其發生率、病變程度經組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），故認為紫連膏對家兔給藥部位皮膚無組織病理學意義上的皮膚刺激性。通過分析，雖肉眼觀察評價及組織病理學檢查均表明部分動物給藥部位皮膚均存在一定的刺激癥狀反應，但由于皮膚產生的刺激反應較輕，僅在肉眼評價上表現出輕度刺激性，還尚未達到排除操作產生的刺激因素外的組織病理學刺激性病變因素的組間差異程度，故兩種方法獲得的評價結果具有一定的差異。因此，從皮膚刺激的評價標準判斷，認為紫連膏高劑量可能對家兔涂擦部位皮膚產生輕度刺激性。

綜上所述，在本試驗條件下，紫連膏以終劑量50.0 mg/cm2（劑量為8.33 g/kg，相當于人臨床最大擬用劑量的3.1 倍）給藥4 周，可對涂擦部位皮膚產生輕度刺激。在臨床應用中，完整皮膚經長期重復涂擦給藥后，應重點監測凝血指標和LDH、GLU 指標的變化，以及涂擦部位皮膚刺激反應情況。另外，通過上述紫連膏的功能主治，且無破損皮膚的使用禁忌，故推測其在破損性皮膚疾病中也可使用，因此本團隊關于紫連膏對破損皮膚重復給藥毒性安全性也進行了研究，安全性評價結果將在另外一篇文章中進行報道。