基于網絡藥理學和體內實驗探究黃蜀葵花總黃酮治療急性腎損傷的分子機制

詹倩，王富江，葛海濤，?

（1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；2.江蘇蘇中藥業研究院有限公司，江蘇 南京 211198）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種表現為腎功能快速下降和代謝廢物蓄積的常見臨床綜合征，具體表現為血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血清肌酐（serum creatinine，Scr）水平升高，水、電解質和酸堿失衡，以及全身各系統癥狀，可伴隨少尿或無尿［1］。據2015年國際腎臟病學會報道，每年約有1 330萬人發生急性腎損傷，并且每年因急性腎損傷而死亡的人數約有170萬［2］。目前臨床治療急性腎損傷主要采用液體復蘇、藥物防治和腎臟替代療法等方法，藥物治療包括抑制細胞死亡類、抗炎類和修復類藥物等，由于各種原因，這些療法并未取得很好的臨床療效［3］。因此尋找減緩腎損傷、改善腎功能的藥物具有重要意義。

黃蜀葵花總黃酮（total flavonoids ofAbelmoschus manihot，TFA）是從中藥黃蜀葵花中提取的黃酮類組分，含有槲皮素、蘆丁、異槲皮苷、金絲桃苷、楊梅素等多種黃酮成分，研究表明，這些黃酮成分具有抑制免疫反應、改善腎纖維化、抗炎、改善腎功能和減輕腎損傷等藥理作用［4-5］。已有研究發現TFA 可能是通過抑制ROS，繼而下調NLRP3、Caspase-1蛋白的表達，從而抑制ROS/NLRP3 信號通路減輕阿霉素誘導的腎損傷［6］，但目前TFA治療急性腎損傷的作用機制研究較少，尚不全面。

網絡藥理學是基于數據庫挖掘相關信息，揭示藥物成分核心靶點，在理解疾病的分子基礎上，預測藥物的藥理學作用機制，評估藥物的藥效、作用途徑和分子機制。本研究擬利用網絡藥理學相關數據庫和動物實驗靶點驗證，初步探究TFA 治療阿霉素誘導的急性腎損傷的分子機制，為進一步深入研究奠定理論基礎。

1 資料與方法

1.1 黃蜀葵花黃酮類成分的收集

在中國知網數據庫（https：//www.cnki.net/）中，以“黃蜀葵花總黃酮”為檢索詞，獲取TFA 成分相關信息，檢索黃蜀葵花總黃酮含有成分種類及信息。利用化源網（https：//www.chemsrc.com/）查詢成分CAS 號，通過PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取成分結構信息，保存為“SMILES”格式。

1.2 黃蜀葵花黃酮類化合物靶點預測

將獲得的黃酮類化合物“SMILES”格式導入Swiss TargetPrediction 數據庫（https：//www.expasy.org/resources/swisstargetprediction），設置物種為“Homo sapiens”，得到藥物的預測靶點，將從化源網中得到的化合物英文名稱導入中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），得到黃酮類成分的已驗證靶點。將以上步驟所得到的靶點信息導入Uniprot 數據庫（https：//www.uniprot.org/），統一靶點的Uniprot ID，刪除重復值，整理得到TFA的相關靶點。

1.3 疾病靶點的預測

在GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/）中以“acute kidney injury”為關鍵詞搜索，以相關系數大于2 倍中位數篩選，在Disgenet 數據庫（https：//www.disgenet.org/）中以“acute kidney injury”為關鍵詞搜索，兩者取并集得到疾病相關靶點。

1.4 篩選共同靶點

運用易漢博生物信息在線作圖工具（http：//www.ehbio.com/ImageGP/）將化合物靶點和疾病靶點映射，獲得化合物和疾病的共同靶點并繪制韋恩圖，即得到TFA治療急性腎損傷可能的作用靶點。

1.5 核心靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建

將化合物和疾病的共同靶點信息導入STRING 平臺（https：//string-db.org/）中構建PPI 網絡，設置物種為“Homo sapiens”，相關性≥0.7，即可獲得共同靶點的PPI 網絡，導入Cytoscape 3.8.0 軟件中，構建成分-潛在靶點網絡圖。相關信息導入Cytoscape 3.8.0軟件中，以大于Degree 值中位數2 倍篩選核心靶點，得到核心靶點PPI網絡圖。

1.6 核心靶點通路分析和可視化

將上述獲得的核心靶點信息導入生物學信息注釋數據庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）中，對其進行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路注釋分析，運用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/login/）制作GO 富集分析結果的柱狀圖、氣泡圖和KEGG 通路注釋分析結果的氣泡圖，并將相關信息輸入Cytoscape 3.8.0 軟件中，構建成分-靶點-通路網絡圖。

1.7 動物實驗驗證

1.7.1 動物

SPF 級KM 小鼠，雄性，體質量25～30 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（遼）2020-0001。動物飼養于清潔級動物房中，12 h光照，恒溫21～23 ℃、恒濕45%～65%，自由飲食、飲水。

1.7.2 藥物、試劑與儀器

黃蜀葵花總黃酮干粉（江蘇蘇中藥業研究院有限公司，批號：20200929）用蒸餾水溶解制成劑量為228 mg/kg的混懸液。

阿霉素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號：A183027）；MAPK 抗體（英國Abcam 公司，批號：ab170099）；Akt抗體（英國Abcam 公司，批號：ab8805）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：C0105M）；過碘酸-雪夫（PAS）染色試劑盒（上海碧云天生物術有限公司，貨號：C0142S）。

全自動組織包埋機（德國徠卡儀器有限公司，型號：HistoCore Arcadia H）；全自動輪轉式切片機（德國徠卡儀器有限公司，型號：HistoCore AUTOCUT-149AUTO00C1）；全自動生化分析儀（德國SIEMENS公司，型號：Dimension EXL200）；倒置顯微鏡（德國LEICA公司，型號：DM75M）。

1.7.3 阿霉素腎損傷模型建立及動物分組

30 只KM 小鼠適應性喂養1 周后，隨機分為正常組、模型組和給藥組，每組10 只。除正常組外，模型組和給藥組以11 mg/kg 劑量尾靜脈注射阿霉素（溶于生理鹽水）構建急性腎損傷動物模型。2 周后檢測24 h尿蛋白，24 h尿蛋白顯著高于正常組則視為造模成功。給藥組小鼠按228 mg/kg 的劑量灌胃給予黃蜀葵花總黃酮混懸液，正常組與模型組小鼠按相同體積灌胃蒸餾水。每日給藥1 次，給藥1 個月后取腎臟，用10%福爾馬林溶液固定。

1.7.4 標本采集、處理及指標檢測

取組織固定液固定后的腎臟，用石蠟包埋，切成4μm 的腎切片，進行HE 染色和PAS 染色，觀察病理結構變化，采用二次免疫組化法檢測Akt和MAPK表達水平，每組選取3 只小鼠病理切片，使用CaseViewer 軟件放大200倍，每只小鼠病理切片中隨機選取5個相等面積的視野區域，用Image J軟件計算平均光密度（MOD）。

1.7.5 統計學方法

采用GraphPad prism 8軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組獨立數據比較采用單因素方差分析，不符合正態分布，則采用非參數檢驗（Kruskal-Wallis test），以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物與疾病相關靶點篩選結果

經檢索及匯總刪重后，共獲得TFA 相關靶點基因255個；在GeneCards數據庫和Disgenet數據庫中，經篩選后共檢索到AKI 相關靶點基因1 830 個。將上述靶點信息輸入易漢博生物信息在線作圖工具，繪制韋恩圖，得到成分-疾病共同靶點基因169個。見圖1。

2.2 成分-靶點網絡圖的構建

采用Cytoscape 3.8.0軟件構建成分-交集靶點網絡圖。M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9 和M10 依次為異鼠李素-3-β-D-葡萄糖苷（Isorhamnetin-3-mono-beta-D-glucoside）、槲皮素（quercetin）、蘆丁（rutin）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（Quercetin-3-O-beta-D-glucopyranoside）、楊梅素（myricetin）、棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（Hibifolin）、棉皮素-7-O-α-吡喃鼠李糖苷（Rhodiolgin）、4'，5，7，8-四甲氧基黃酮（4'，5，7，8-Tetramethoxyflavone）、槲皮素-3-O-洋槐糖苷（Quercetin 3-O-robinobioside）和槲皮素-7-Oβ-D-葡萄糖苷（Quercetin-7-O-beta-Dglucopyranoside）。圓形節點顏色越深，顯示圓形節點之間相互作用越強。見圖2。

2.3 核心靶點PPI網絡的構建

采用Cytoscape 3.8.0軟件計算Degree值篩選核心靶點28 個，其靶點基因信息見表1。將靶點信息導入STRING 數據庫中，得到核心靶點PPI網絡圖，該PPI網絡涉及到28 個蛋白，236 條相互作用關系，結果提示STAT3、AKT1、MAPK1、TP53、PIK3CA、JUN、RELA、SRC、TNF、VEGFA、EGFR 等可能是TFA 防治急性腎損傷的作用靶點。見圖3。

表1 核心靶點基本信息表

2.4 GO富集分析結果

DAVID 數據庫共富集到GO 功能條目327 個，生物學過程（biological process，BP）、細胞定位（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）分別有289、26 和52 個。其中，BP 主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控、MAPK 級聯激活、凋亡過程的負調控、一氧化氮生物合成過程的正調控、細胞增殖的正調控和藥物反應等；CC主要涉及細胞核、細胞溶質、細胞外組分和受體復合物等；MF主要涉及相同蛋白質結合、酶結合、轉錄因子結合、蛋白質結合和受體結合等。GO 功能富集分析柱狀圖（BP、CC、MF 各取P值排名前10位）見圖4。

2.5 KEGG通路富集分析結果及成分-靶點-通路網絡圖的構建

DAVID 數據庫共富集到KEGG信號通路99條，根據P值選取前20位進行展示，見圖5。有顯著性的通路包括Toll樣受體信號通路、乙型肝炎、催乳素信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、PI3K/Akt信號通路、碎骨細胞分化、T細胞受體信號通路和甲狀腺激素信號通路等。采用Cytoscape 3.8.0軟件構建成分-靶點-通路網絡圖，見圖6。其中M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10與圖2中代表含義相同，網絡結果顯示，各成分可能通過調控MAPK1、AKT1、TP53、CCND1、TNF、STAT1、PIK3CA、IL2和NFKBIA等靶點基因的表達，干預相關通路治療AKI。

2.6 動物實驗驗證

2.6.1 HE、PAS染色結果觀察

各組小鼠的腎臟組織HE 染色、PAS 染色結果顯示，與正常組相比，模型組小鼠腎組織皮質深部腎小管上皮細胞輕度水腫，形態學表現為腎小管上皮細胞胞漿疏松淡然，腎小管固縮，腎小球基底膜增厚；與模型組相比，給藥組小鼠腎組織腎小球基底膜輕微增厚，較模型組有所改善。見圖7。

2.6.2 Akt、MAPK在小鼠腎組織中的表達

與正常組相比，模型組的Akt 表達顯著下降（P＜0.01），MAPK的表達顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組的Akt 表達顯著上升（P＜0.01），MAPK 的表達顯著下降（P＜0.05）。見表2和圖8、圖9。

表2 各組小鼠腎臟組織中Akt和MAPK蛋白表達情況比較（±s）

表2 各組小鼠腎臟組織中Akt和MAPK蛋白表達情況比較（±s）

注：與正常組相比，##P ＜0.01；與模型組相比，*P ＜0.05。

組別劑量（mg/kg）正常組模型組給藥組MAPK（平均光密度/mm2）0.075 8±0.008 5 0.129 5±0.025 3##0.110 0±0.023 8*— —228 Akt（平均光密度/mm2）0.181±0.073 0.076±0.015##0.117±0.039*

3 討論

AKI 是一種短時間內腎功能迅速下降的疾病，其發病機制多樣，與缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）、肝移植手術、冠狀動脈搭橋手術、橫紋肌溶解癥、膿毒癥以及藥物等相關，其中缺血/再灌注損傷與細胞內Ca2+超載、大量活性氧產生、炎癥反應和細胞凋亡介導的腎損傷密切相關［7］。AKI 有發展成慢性腎病和終末期腎病的風險，因此進行AKI 相關研究具有重要意義。目前根據臨床癥狀多將其歸為“癃閉”“關格”等范疇［8］，通常認為其病因病機主要與外邪侵襲、藥毒傷腎等有關。黃蜀葵花歸腎、膀胱經，目前已研發成新藥——黃葵膠囊，用于治療慢性腎炎、糖尿病腎病以及腎病綜合征等。

本研究通過網絡藥理學篩選得到169 個TFA 治療急性腎損傷的潛在靶點，通過進一步篩選得到28 個核心靶點，核心靶點包括STAT3、AKT1、MAPK1、TP53、PIK3CA、JUN、RELA、SRC、TNF、VEGFA 和EGFR 等。AKT1 是參與機體產生AKI 分子機制中一個重要靶點基因，已有研究證明AKT1 的缺失可以加劇腎缺血再灌注損傷時的腎小管凋亡和炎癥反應，進而加劇腎功能障礙和病理損害［9］，且腎小管線粒體AKT1的表達可以減輕腎損傷，保護腎功能［10］。AKT1 包含于Akt，說明Akt 可能是治療AKI 的關鍵靶點。除了AKT1，MAPK 也有可能是治療AKI 的一個關鍵靶點，有研究發現機體產生急性腎損傷的分子機制中涉及p38MAPK、JUK 的表達［11］，而MAPK 家族成員包括MAPK1、JNK、p38MAPK 和ERK 等［12］，在調節炎癥和免疫反應中也起重要作用。

TFA 中含有黃酮成分槲皮素，研究發現槲皮素可通過顯著抑制由脂多糖（LPS）引起小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW 264.7 cells）炎癥反應過程中JNK、p38MAPK 的激活來降低炎癥介質水平［13］，說明TFA 可能會通過抑制體內JNK、p38MAPK 的激活來達到抗炎作用，降低腎臟炎癥反應。孫軍等［14］在研究槲皮素對血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）保護作用機制時發現，槲皮素在增強EPCs細胞繁殖能力的同時，可升高EPCs 中Akt 以及磷酸化Akt 的蛋白表達量，以及PI3K 和Akt3 mRNA 表達，可見槲皮素可能通過PI3K/Akt 信號通路來發揮EPCs 保護作用。在內皮損傷后，EPCs可由骨髓動員并歸巢于損傷部位參與血管修復及新生血管形成，從而對體內多個器官損傷血管進行修復［15］，由此可見，TFA 可能通過上調體內Akt表達，干預PI3K/Akt信號通路來保護腎臟EPCs，修復腎臟內損傷部位。趙青等［16］發現黃葵膠囊（黃蜀葵花提取物）可通過下調腎組織p38MAPK 的蛋白表達，減少腎組織內炎癥細胞的浸潤、活化，改善腎組織的炎癥性損傷。以上研究結果提示，Akt 與MAPK 可能是TFA治療AKI的作用靶點。

GO 富集分析結果顯示，可能的生物過程為MAPK級聯激活、凋亡過程負調控和細胞增殖正調控等。KEGG 富集分析結果顯示，可能的信號通路為Toll 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路、TNF 信號通路及PI3K/Akt信號通路等。多篇文獻報道PI3K/Akt信號通路、Toll 樣受體信號通路和HIF-1 信號通路與保護相關物質誘導的急性腎損傷作用有關［17-19］。這些通路均為常見炎癥反應相關信號通路，Akt和MAPK在這些通路中起重要作用，炎癥反應會加劇腎損傷，通過對Akt與MAPK的表達進行調控，可減輕炎癥反應，進而減輕腎損傷。動物實驗靶點驗證結果顯示，與模型組相比，給藥組Akt 表達量顯著上調、MAPK 表達量顯著下調，說明TFA 可能通過調控Akt 和MAPK 蛋白的表達，減輕阿霉素誘導小鼠產生的腎損傷。

綜上所述，本研究借助網絡藥理學的方法，收集TFA治療AKI的潛在靶點，并通過PPI網絡構建和GO、KEGG 富集分析，結合動物實驗驗證發現TFA 可能通過上調Akt 表達、下調MAPK 表達，從而減輕阿霉素誘導小鼠產生的腎損傷。AKI 產生的原因有多種，阿霉素誘導的AKI 是屬于藥物毒性引起的，臨床上藥物引起的AKI 時有發生，其相關治療作用靶點的研究可為臨床上治療AKI 提供理論依據，未來還需再進一步對TFA治療AKI的相關通路以及多靶點治療進行研究。