表沒食子兒茶素沒食子酸酯和小米谷糠蛋白的相互作用研究

苗向碩，常城銘，和東芹?

（1.邯鄲職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物工程系，河北 邯鄲 056001；2.河北省高水平實(shí)訓(xùn)基地，河北 邯鄲 056001）

小米谷糠是小米加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。小米谷糠中蛋白質(zhì)組分含量約占15%，小米谷糠蛋白是人們廣泛食用的優(yōu)質(zhì)谷物蛋白，小米谷糠蛋白氨基酸組成合理，比較接近世界衛(wèi)生組織推薦的蛋白質(zhì)的氨基酸比例，小米谷糠蛋白消化率高并且具有很低的過敏性，非常適合開發(fā)特殊人群及嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)食品。小米谷糠蛋白還具有保健及抑制腫瘤細(xì)胞的作用[1]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）在綠茶兒茶素成分中占比最高，EGCG含有多個(gè)酚羥基，具有抗菌、抗氧化、抗炎及抗病毒等特性[2]。由于EGCG安全性高且生物活性強(qiáng)，能夠提高食品中蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值或賦予食品更好的性能，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，因而廣泛應(yīng)用于各類食品[3]。

在食品體系中，EGCG會(huì)和蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，進(jìn)而改變食品體系中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能，并進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)的消化性質(zhì)。因此EGCG與食品蛋白質(zhì)相互作用的研究成為熱點(diǎn)。近年來富含小米谷糠蛋白和 EGCG的相關(guān)食品已有報(bào)道[4-6]，而并沒有 EGCG與小米谷糠蛋白相互作用的研究，本文采用內(nèi)源熒光光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜和紫外-可見光譜法研究 EGCG與小米谷糠蛋白的相互作用，為開發(fā)含有EGCG和小米谷糠蛋白天然成分的復(fù)合食品及改善其品質(zhì)提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

小米谷糠：河北威縣保榮米業(yè)有限公司；EGCG（純度≥98%）：上海源純生物科技有限公司；其它試劑均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司等。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Sorvall LYNX 6000高速落地離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher公司；真空冷凍干燥機(jī)：北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司；F4700熒光分光光度計(jì)：日本日立公司；T6紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小米谷糠蛋白提取

參考曹闊[7]的方法并稍作修改。以小米谷糠為原料，磨粉過80目篩，然后用正己烷充分浸泡小米谷糠，料液比為1∶5（w/v），然后密封置于35 ℃的恒溫箱中浸泡 12 h，后倒出上層溶劑，重復(fù)進(jìn)行上述操作。抽濾后自然晾干就可得到脫脂小米谷糠。將小米谷糠與去離子水混合，料液比為1∶10（w/v），超聲30 min后，將料液置于45 ℃的恒溫?cái)嚢杵髦谐浞謹(jǐn)嚢? h，攪拌期間不斷用1 mol/L NaOH調(diào)整料液pH，并使得pH值始終保持在9.0，然后在4 ℃，8 500 r/min的條件下，將懸浮液離心 15 min，并將上清液用1 mol/L HCL調(diào)pH至4，靜置20 min，然后在4 ℃，8 000 r/min的條件下將料液離心20 min，沉淀用水洗3次，加入適量的去離子水，將蛋白沉淀分散均勻，并用1 mol/L NaOH將蛋白調(diào)pH至7.0，冷凍干燥后得到實(shí)驗(yàn)用小米谷糠蛋白。

1.3.2 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

用pH 7.4的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液配制小米谷糠蛋白溶液濃度至1.5 mg/mL，將2 mL小米谷糠蛋白溶液加入10 mL試管中，隨后加入不同體積濃度為2 mg/mL的EGCG溶液，再用pH 7.4的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液將體積定容至3 mL，使得小米谷糠蛋白最終濃度為1 mg/mL，得到質(zhì)量比為（1∶0、1∶0.005、1∶0.01、1∶0.02、1∶0.04、1∶0.06、1∶0.08、1∶0.10，小米谷糠蛋白∶EGCG，w/w）的小米谷糠蛋白- EGCG混合液，并將兩者充分混合均勻，掃描前將樣品置于17、25、37 ℃的恒溫水浴鍋中保溫5 min。激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為 290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)置為 300～450 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度依次設(shè)置為5和10 nm，掃描速度設(shè)置為1 200 nm/min，在上述條件下測(cè)定小米谷糠蛋白的內(nèi)源熒光光譜。

1.3.3 同步熒光光譜測(cè)定

樣品制備方式同1.3.2，測(cè)定溫度條件為298 K，分別設(shè)置Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm，激發(fā)狹縫寬度為5 nm，發(fā)射狹縫寬度為10 nm，掃描速度設(shè)置為1 200 nm/min，掃描波長(zhǎng)范圍為250～450 nm的小米谷糠蛋白同步熒光光譜。

1.3.4 三維熒光光譜測(cè)定

樣品制備方式同1.3.2，測(cè)定溫度條件為298 K，起始激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為 200 nm，激發(fā)波長(zhǎng)范圍為200～350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為300～500 nm，激發(fā)狹縫寬度為5 nm，發(fā)射狹縫寬度為10 nm，掃描速度設(shè)置為1 200 nm/min，每間隔10 nm記錄1次，共掃描21次。

1.3.5 紫外-可見光譜測(cè)定

配置濃度為1 mg/mL的小米谷糠蛋白溶液，取3 mL上述蛋白溶液于石英比色池中，掃描波長(zhǎng)范圍為250～500 nm內(nèi)的吸收光譜，測(cè)定溫度條件為298 K，掃描完畢后，將不同質(zhì)量濃度的小米谷糠蛋白-EGCG混合液充分混勻后靜置5 min加入到比色池中，在溫度條件為298 K時(shí)掃描吸收光譜。將濃度為1 mg/mL的小米谷糠蛋白溶液作為空白，記錄小米谷糠蛋白溶液的紫外-可見吸收差譜。

1.3.6 EGCG與小米谷糠蛋白結(jié)合距離的測(cè)定

配制濃度均為2×10-5mol/L 的小米谷糠蛋白和EGCG溶液，在25 ℃的條件下恒溫水浴保溫5 min。EGCG的紫外光譜測(cè)定：移取2×10-5mol/L的EGCG溶液3 mL于石英比色池中，掃描300～400 nm的紫外吸收光譜。小米谷糠蛋白溶液熒光光譜測(cè)定：移取3 mL小米谷糠蛋白溶液于石英比色池中，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為300～400 nm，激發(fā)狹縫寬度為5 nm，發(fā)射狹縫寬度為10 nm，掃描速度設(shè)置為1 200 nm/min，測(cè)定溫度條件為298 K。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次。采用Microsoft Excel 2010和Origin Pro 8處理數(shù)據(jù)和繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG與小米谷糠蛋白相互作用的熒光光譜

2.1.1 EGCG濃度對(duì)小米谷糠蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

小米谷糠蛋白的內(nèi)源熒光光譜可以反映蛋白中色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸殘基附近微環(huán)境的改變。在本實(shí)驗(yàn)條件下，由于EGCG的濃度很小，所產(chǎn)生的熒光發(fā)射信號(hào)很弱，可以忽略EGCG對(duì)小米谷糠蛋白熒光信號(hào)的干擾，因而不考慮文中“內(nèi)濾光效應(yīng)”的干擾問題[8]。圖1表明，隨著EGCG濃度的增大，小米谷糠蛋白的熒光強(qiáng)度顯著降低，說明EGCG大幅度淬滅了小米谷糠蛋白的內(nèi)源熒光；同時(shí)，小米谷糠蛋白最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)由345 nm紅移至368 nm，表明隨著EGCG濃度的逐漸增大，小米谷糠蛋白的芳香族氨基酸殘基微環(huán)境疏水性降低，極性增強(qiáng)，小米谷糠蛋白空間結(jié)構(gòu)逐漸變得更加延伸[9]。

圖1 不同濃度EGCG對(duì)小米谷糠蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.1 Endogenous fluorescence spectra of millet bran protein at different concentrations of EGCG

2.1.2 EGCG濃度對(duì)小米谷糠蛋白同步熒光光譜的影響

同步熒光光譜不僅可以區(qū)分開小米谷糠蛋白酪氨酸殘基和色氨酸殘基特征光譜，還可進(jìn)一步判斷EGCG與小米谷糠蛋白相互作用位點(diǎn)更接近酪氨酸殘基或色氨酸殘基。Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm時(shí)分別顯示酪氨酸殘基和色氨酸殘基的光譜特征[10]。由圖2可以看出，Δλ=15時(shí)，小米谷糠蛋白酪氨酸殘基的同步熒光強(qiáng)度隨著EGCG濃度的增加而降低，最大發(fā)射波長(zhǎng)由359.4 nm紅移至367.4 nm，當(dāng)Δλ=60 nm時(shí)，小米谷糠蛋白色氨酸殘基的同步熒光強(qiáng)度隨著EGCG濃度的增加降低，最大發(fā)射波長(zhǎng)由289.4 nm紅移至292.2 nm，隨著EGCG濃度的升高，色氨酸殘基的同步熒光強(qiáng)度降低程度更明顯，表明EGCG和小米谷糠蛋白相互作用同時(shí)影響酪氨酸殘基和色氨酸殘基微環(huán)境的疏水性，但對(duì)色氨酸殘基周圍微境影響程度更大，EGCG在小米谷糠蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)更靠近色氨酸殘基，小米谷糠蛋白結(jié)構(gòu)變得疏松，與內(nèi)源熒光光譜結(jié)果一致。由于不考慮“內(nèi)濾光效應(yīng)”的干擾，Δλ=15 nm 的光譜峰型出現(xiàn)鋸齒狀，筆者認(rèn)為其與靈敏度參數(shù)設(shè)置有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

圖2 不同濃度EGCG對(duì)小米谷糠蛋白同步熒光光譜的影響Fig.2 Synchronous fl uorescence spectra of millet bran protein with different concentrations of EGCG

2.1.3 EGCG濃度對(duì)小米谷糠蛋白三維熒光光譜的影響

三維熒光光譜中的峰位、顏色和指紋信息可以反映蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度和構(gòu)象變化。如圖3所示，峰a（Ex=Em）為瑞利散射峰，峰b（Em= 2Ex）為二級(jí)散射峰，峰1為小米谷糠蛋白色氨酸和酪氨酸殘基特征峰，峰2代表多肽鏈主鏈上的C==O結(jié)構(gòu)的π→π*躍遷產(chǎn)生的熒光峰[9]。如圖3所示，加入EGCG后，峰1顏色明顯變淺，等高線變得明顯稀疏，表明EGCG能淬滅小米谷糠蛋白熒光，EGCG與小米谷糠蛋白之間存在相互作用。峰 2顏色變淺，面積發(fā)生改變，表明小米谷糠蛋白質(zhì)多肽鏈骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。表1中的峰1數(shù)據(jù)顯示，小米谷糠蛋白的色氨酸和酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)出現(xiàn)了紅移，說明小米谷糠蛋白色氨酸和酪氨酸殘基周圍的微環(huán)境極性增強(qiáng)，疏水性降低，與小米谷糠蛋白的內(nèi)源熒光和同步熒光光譜變化結(jié)果一致。峰b的熒光強(qiáng)度下降的原因可能是兩者相互作用使小米谷糠蛋白表面的保護(hù)水層受到破壞，小米谷糠蛋白更加分散，導(dǎo)致小米谷糠蛋白粒徑變小，降低了小米谷糠蛋白的光散射作用，從而降低二級(jí)散射峰的熒光強(qiáng)度，表明EGCG和小米谷糠蛋白相互作用形成不發(fā)光基態(tài)復(fù)合物。

圖3 未添加EGCG和EGCG濃度為0.04 mg/mL的小米谷糠蛋白等高線圖Fig.3 Contour map of millet bran protein and EGCG-millet bran protein system (0.04 mg/mL)

表1 EGCG-小米谷糠蛋白體系三維熒光光譜特征參數(shù)Table 1 Characteristic parameters for the three-dimensional fluorescence spectra of EGCG and millet bran protein system

2.2 EGCG與小米谷糠蛋白相互作用的紫外-可見吸收光譜

紫外-可見吸收光譜是研究復(fù)合物形成和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的簡(jiǎn)單而有效的方法[11]。動(dòng)態(tài)猝滅只影響到蛋白分子的激發(fā)態(tài)，不會(huì)改變蛋白的紫外吸收光譜，靜態(tài)猝滅由于生成新的基態(tài)復(fù)合物而導(dǎo)致吸收光譜的改變。蛋白的特征吸收峰（大約280 nm）主要是包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸在內(nèi)的芳香族氨基酸的吸收峰[12]。由圖4可得，隨著EGCG含量增加，小米谷糠蛋白吸光度逐漸上升，表明EGCG與小米谷糠蛋白相互作用形成基態(tài)復(fù)合物。隨著EGCG濃度的增加，芳香族氨基酸最大吸收峰波長(zhǎng)發(fā)生紅移，與同步熒光結(jié)果的變化一致，一方面可能是由于小米谷糠蛋白中色氨基酸殘基被EGCG結(jié)合，另一方面可能是兩者相互作用使色氨酸殘基位置發(fā)生移動(dòng)，新的共軛體系由此產(chǎn)生，使π-π*躍遷能量增大[13]。耿子蔚[12]等研究不同茶湯與乳清蛋白相互作用時(shí)紫外-可見吸收光譜峰型也出現(xiàn)鋸齒狀，筆者認(rèn)為其與靈敏度參數(shù)設(shè)置有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

圖4 不同濃度EGCG對(duì)小米谷糠蛋白紫外-可見吸收光譜的影響Fig.4 UV-Vis absorption spectra of millet bran protein with different mass concentrations of EGCG

2.3 EGCG與小米谷糠蛋白相互作用機(jī)制

2.3.1 熒光淬滅機(jī)制

內(nèi)源熒光光譜結(jié)果表明，EGCG能顯著淬滅小米谷糠蛋白的熒光，分析它們的淬滅機(jī)制可以更準(zhǔn)確地判斷兩者相互作用是否形成了復(fù)合物。熒光淬滅機(jī)制總共包括3類，分別為靜態(tài)淬滅機(jī)制、動(dòng)態(tài)淬滅機(jī)制和動(dòng)態(tài)靜態(tài)混合淬滅機(jī)制。動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑和處在激發(fā)態(tài)的熒光物質(zhì)碰撞而引發(fā)，隨著溫度升高，動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)增大。靜態(tài)猝滅是猝滅劑和處于基態(tài)的熒光物質(zhì)形成了復(fù)合物，隨著溫度升高，復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，因此猝滅常數(shù)隨著溫度升高而降低[14]。可采用Stern-Volmer方程[13]計(jì)算不同溫度下的淬滅常數(shù)，由此判斷EGCG與小米谷糠蛋白相互作用淬滅機(jī)制。

第三，多媒體激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣。歷史課堂教學(xué)過程中，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣可通過新技術(shù)的應(yīng)用。傳統(tǒng)歷史教學(xué)當(dāng)中學(xué)生處在被動(dòng)的位置，并且整個(gè)課堂是靜態(tài)的，在新的教學(xué)環(huán)境下，就要充分注重教學(xué)模式的創(chuàng)新。多媒體技術(shù)在歷史教學(xué)課堂當(dāng)中加以應(yīng)用，就能為學(xué)生呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)化的學(xué)習(xí)環(huán)境，這對(duì)激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣就有著積極意義。通過多媒體的應(yīng)用將歷史教學(xué)內(nèi)容和影片相結(jié)合，讓學(xué)生通過動(dòng)態(tài)化的視頻呈現(xiàn)了解歷史，這就能激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣。

Stern-Volmer方程如下：

式中：F0和F分別是EGCG加入前后的小米谷糠蛋白熒光強(qiáng)度；[Q]是EGCG濃度（mol/L）；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)（L/(mol·s)）；Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)（L/mol）；τ0為不存在猝滅劑時(shí)熒光體的壽命（生物大分子的平均壽命約為10-8s）。

由圖5中直線的斜率得到Ksv，由τ0得到Kq（表2）。當(dāng)R2不大于0.98時(shí)，表明淬滅機(jī)制可能為動(dòng)態(tài)靜態(tài)混合淬滅[15]。由圖5所示，EGCG濃度較低時(shí)，Stern-Volmer曲線呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，EGCG濃度較高時(shí)，Stern-Volmer曲線逐漸偏向縱坐標(biāo)軸，表明EGCG與小米谷糠蛋白相互作用同時(shí)存在靜態(tài)淬滅和動(dòng)態(tài)淬滅[16]，隨著溫度升高，Ksv的值不斷增大，表明 EGCG與小米谷糠蛋白相互作用存在動(dòng)態(tài)淬滅機(jī)制。另外，由于不同溫度下Kq達(dá)到1012或1013，顯著高于最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)（約為 2×1010L/(mol·s)），表明 EGCG 對(duì)小米谷糠蛋白的猝滅機(jī)制也存在靜態(tài)淬滅，結(jié)合分析熒光光譜和紫外-可見吸收光譜的變化結(jié)果，靜態(tài)淬滅在EGCG淬滅小米谷糠蛋白熒光過程中起主導(dǎo)作用[17]。

圖5 不同溫度條件下EGCG對(duì)小米谷糠蛋白熒光猝滅的Stern-Volmer方程曲線圖Fig.5 Stern-Volmer plots of millet bran protein interacting with EGCG at different temperatures

表2 EGCG-小米谷糠蛋白復(fù)合物的熒光淬滅常數(shù)及相關(guān)系數(shù)Table 2 Quenching rate constants and correlation coef fi cients of millet bran protein and EGCG

2.3.2 EGCG-小米谷糠蛋白復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

可以采用以下等式確定結(jié)合常數(shù)（KA）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）[12]：

式中：F0表示沒有加入EGCG時(shí)的熒光強(qiáng)度；F表示加入EGCG時(shí)的熒光強(qiáng)度；KA為表觀結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；[Q]為EGCG的濃度。

從圖6和表3中可以看出，結(jié)合常數(shù)KA的數(shù)量級(jí)為106，相關(guān)研究報(bào)道EGCG與乳清蛋白[12]相互作用KA數(shù)量級(jí)是104，表明EGCG與小米谷糠蛋白之間結(jié)合力更強(qiáng)，可能是由于小米谷糠蛋白與乳清蛋白結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致兩者數(shù)量級(jí)出現(xiàn)差異。隨著溫度升高，KA值不斷增大，一方面說明EGCG對(duì)小米谷糠蛋白的淬滅反應(yīng)是吸熱反應(yīng)，同樣也表明其淬滅過程有動(dòng)態(tài)淬滅。在三個(gè)不同溫度條件下，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n全部約等于1，表明EGCG和小米谷糠蛋白形成1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

圖6 不同溫度條件下EGCG熒光猝滅小米谷糠蛋白的雙對(duì)數(shù)曲線Fig.6 Double logarithmic curves of millet bran protein quenched by EGCG at different temperatures

表3 EGCG-小米谷糠蛋白復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、表觀結(jié)合常數(shù)及相關(guān)系數(shù)Table 3 Apparent binding constants, binding sites numbers,and correlation coefficients of millet bran protein and EGCG

2.3.3 EGCG-小米谷糠蛋白復(fù)合物的熱力學(xué)參數(shù)和作用力類型

式中：R為氣體常數(shù) 8.314 J/(K·mol)；T為實(shí)驗(yàn)溫度；KA為不同溫度的結(jié)合常數(shù)（見表3）。

如表4所示，ΔG＜0，表明EGCG與小米谷糠蛋白的反應(yīng)可自發(fā)進(jìn)行。ΔH＞0，表明 EGCG與小米谷糠蛋白之間反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，升溫有利于反應(yīng)進(jìn)行，這與表3計(jì)算的KA隨溫度升高而增大一致。ΔH＞0、ΔS＞0表明EGCG與小米谷糠蛋白相互作用力類型主要是疏水相互作用。

表4 不同溫度下EGCG與小米谷糠蛋白相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 4 Thermodynamic parameters for interaction between EGCG and millet bran protein

2.3.4 EGCG與小米谷糠蛋白的能量轉(zhuǎn)移和結(jié)合距離

根據(jù) F?ster’s偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，蛋白質(zhì)和小分子配體之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移需要滿足以下條件：蛋白質(zhì)給體能發(fā)射熒光，蛋白熒光發(fā)射光譜與小分子配體的紫外吸收光譜有重疊，蛋白質(zhì)與配體間結(jié)合距離小于7 nm。由以下公式可計(jì)算兩者重疊積分J、能量轉(zhuǎn)移效率E、結(jié)合距離r及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0[19]。

式中，F(xiàn)(λ)為蛋白質(zhì)給體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度；E為能量轉(zhuǎn)移效率；F和F0分別表示添加淬滅劑前后蛋白熒光強(qiáng)度；ε(λ)則為小分子配體在波長(zhǎng)λ處摩爾消光系數(shù)；J是重疊面積積分；R0是指能E=50%時(shí)的臨界距離；r為結(jié)合距離；K2為偶極空間取向因子（值為2/3）；N為介質(zhì)折射指數(shù)（值為1.336）；Φ為給體熒光量子效率（值為 0.118）。

由圖 7根據(jù)公式（7）計(jì)算得J=1.207 2×10-14(cm3·L/mol)，E=0.602 9，R0=2.530 1 nm，r=2.341 8 nm。結(jié)合距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于7 nm，而且結(jié)合距離符合0.5R0＜r＜1.5R0，這表明小米谷糠蛋白與EGCG存在非輻射能量轉(zhuǎn)移。EGCG淬滅小米谷糠蛋白熒光原因可能是兩者之間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移引起的[19]。同時(shí)，EGCG與小米谷糠蛋白結(jié)合距離r值較小同樣表明兩者之間存在相互作用。

圖7 EGCG紫外吸收光譜和小米谷糠蛋白熒光發(fā)射光譜重疊圖Fig.7 Spectral overlap of EGCG absorption spectrum and millet bran protein fl uorescence spectrum

2.3.5 EGCG與小米谷糠蛋白結(jié)合率的預(yù)測(cè)

EGCG的小米谷糠蛋白結(jié)合率能直觀的體現(xiàn)出EGCG-小米谷糠相互作用強(qiáng)度。當(dāng)兩者相互作用達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，同時(shí)兩者結(jié)合位點(diǎn)數(shù)接近 1時(shí)，可以建立兩者結(jié)合率的理論模型。以下公式可表征結(jié)合常數(shù)（KA）和結(jié)合率（Y）之間的關(guān)系[20]：

式中，Y是結(jié)合率；KA結(jié)合常數(shù)；P是小米谷糠蛋白濃度；X是EGCG與小米谷糠蛋白的濃度比。運(yùn)用公式（8）計(jì)算不同溫度時(shí) EGCG的小米谷糠蛋白結(jié)合率。

如圖8所示，EGCG 的小米谷糠蛋白結(jié)合率具有明顯的濃度依賴性，隨著EGCG濃度增大，結(jié)合率逐漸減小，溫度變化對(duì)結(jié)合率產(chǎn)生影響，尤其是 290 K時(shí)變化較明顯。由圖 8得到溫度290、298、310 K時(shí)的兩者濃度比與結(jié)合率曲線方程如下：

圖8 不同溫度條件下EGCG與小米谷糠蛋白的結(jié)合率Fig.8 Binding rate of millet bran protein and EGCG at different temperatures

由公式可見，當(dāng)EGCG與小米谷糠蛋白濃度在一定范圍內(nèi)波動(dòng)時(shí)，EGCG的小米谷糠蛋白結(jié)合率可能出現(xiàn)指數(shù)級(jí)變化，可以通過測(cè)定EGCG和小米谷糠蛋白濃度比，由公式（9）～（11）計(jì)算其結(jié)合率。

3 結(jié)論

通過內(nèi)源熒光光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜和紫外-可見光譜法研究了 EGCG與小米谷糠蛋白的相互作用，內(nèi)源熒光光譜結(jié)果和同步熒光光譜結(jié)果均表明EGCG與小米谷糠蛋白之間存在相互作用，主要影響的是色氨酸殘基在空間結(jié)構(gòu)中所處的微環(huán)境。三維熒光、紫外-可見光譜均證明EGCG影響了色氨酸和酪氨酸殘基微環(huán)境并使小米谷糠蛋白質(zhì)多肽鏈的骨架發(fā)生變化。EGCG引起的小米谷糠蛋白熒光淬滅機(jī)制是動(dòng)靜態(tài)混合猝滅，但以靜態(tài)淬滅為主。EGCG和小米谷糠蛋白結(jié)合常數(shù)KA的數(shù)量級(jí)可達(dá)106，且結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1。熱力學(xué)參數(shù)表明EGCG和小米谷糠蛋白主要以疏水相互作用結(jié)合形成復(fù)合物，反應(yīng)可自發(fā)進(jìn)行。同時(shí)，EGCG與小米谷糠蛋白之間結(jié)合距離遠(yuǎn)小于7 nm，兩者存在能量轉(zhuǎn)移。最后，建立了EGCG與小米谷糠蛋白結(jié)合率的理論模型，發(fā)現(xiàn) EGCG的小米谷糠蛋白結(jié)合率隨著EGCG濃度的增大而減小，溫度變化對(duì)EGCG的小米谷糠蛋白結(jié)合率產(chǎn)生影響。