基于中醫辨證保健理論探索輔助降血糖功能評價方法

孟 靚 王景霞 孟智睿 魏益謙 邵紫萱 李 麗 高學敏 張建軍

(北京中醫藥大學，北京，100029)

糖尿病前期是一種糖代謝異常的狀態，介于糖代謝正常狀態和糖尿病之間[1]。如果不采取有效干預措施，處于糖尿病前期狀態的人群會有很大概率發展成為糖尿病患者[2]。目前我國糖尿病前期人群約為4.934億，且呈逐年高速增長態勢[3]。我國糖尿病患者中，2型糖尿病占90%以上[4]。2型糖尿病絕大多數是可以預防的，對于處在糖尿病前期的亞健康人群來說，通過早期干預，控制血糖和糖耐量的進一步受損，降低患病風險，減少治療花費的經濟負擔，具有重要的現實意義。

保健食品是指具有特定保健功能的食品，適宜于特定人群食用，可以調節機體功能，不以治療疾病為目的[5]。我國保健食品特定的27個功能中就有“輔助降血糖”，在降低疾病風險、預防糖尿病方面發揮著重要的作用[6]。中藥保健食品是以中醫藥理論為指導，結合現代藥理學、藥劑學、營養學、食品學等各學科的最新研究進展，以含有中藥、中藥提取物、藥食兩用等原料為主，研制而成的功能類保健食品[7]。中藥保健食品可依托中醫辨證理論的指導，精細劃分保健食品適宜人群的范圍，使其更加有針對性發揮保健效能，充分體現“辨證”特色[8]。但是在目前的保健食品研發過程中，保健功能的評價卻不能體現中醫的辨證特點，國家2012年發布的《輔助降血糖保健功能評價方法》中，輔助降血糖功能評價方法有2種，一種是損傷胰島高血糖模型，另一種是胰島素抵抗糖脂代謝紊亂模型[9]。這2種方法雖然建立了高血糖模型，但是均不能體現中醫證候特點，只能評價某一中藥保健品的降血糖功能，這就使因人制宜的精準化及個性化保健無法實施，如果使用不對癥的保健食品盲目保健，則還可能適得其反危害機體健康[10]。

糖尿病前期屬于中醫“脾癉”范疇，屬未病階段，如不及時干預則可轉為“消渴”，脾癉可認為是消渴前期，根據中醫辨證可分為濕熱蘊脾、肝郁氣滯、脾虛濕盛和氣陰兩虛4個證型，不同證型的人群臨床表現是不同的，所選擇的中藥必然不同[11]。本研究以輔助降血糖保健功能為切入點，依據中醫對糖尿病前期的認識，通過建立“氣陰兩虛型高血糖動物模型”，探索符合中醫辨證特點的保健食品功能評價體系，為研發輔助降血糖辨證保健產品提供方法學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取45只雄性SD大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006)，體質量(160±20)g，飼養于無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級屏障環境中，大鼠維持飼料由北京科澳協力飼料有限公司提供。特殊高脂飼料(豬油10%、蔗糖15%、蛋黃粉%、酪蛋白5%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、碳酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、鼠維持飼料52.6%)由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供。整個實驗過程中大鼠自由飲水，室溫20～22 ℃，相對濕度為60%～70%，燈照周期為12 h，7：00至19：00燈照，19：00至第2天7：00黑暗。本研究通過北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會審批(倫理審批號：BUCM-4-2019110201-4032)。

1.1.2 藥物 十味消渴膠囊(天津中新藥業集團股份有限公司，生產批號：09950063)。

1.1.3 試劑與儀器 試劑：血清總膽固醇(Total Cholesterol,TC)試劑盒(長春匯力生物技術有限公司，批號：2019009)、三酰甘油(Triacylglycerol，TG)試劑盒(長春匯力生物技術有限公司，批號：2019008)、高密度脂蛋白(High-Density Lipoprotein，HDL)試劑盒(長春匯力生物技術有限公司，批號：2019007)、低密度脂蛋白(Low-Density Lipoprotein，LDL)試劑盒(長春匯力生物技術有限公司，批號：2019011)、空腹胰島素(Fasting Insulin，FINS)試劑盒(優爾生生物科技有限公司，批號：L191102001)、三碘甲狀腺原氨酸(Triiodothyronine，T3)試劑盒(優爾生生物科技有限公司，批號：L191114551)、甲狀腺素(Thyroxine，T4)試劑盒(優爾生生物科技有限公司，批號：L191104072)、環磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate，cAMP)試劑盒(優爾生生物科技有限公司，批號：L191114614)、環磷酸鳥苷(Cyclic Guanosine Monophosphate，cGMP)試劑盒(優爾生生物科技有限公司，批號：L191008130)、L-甲狀腺素鈉試劑盒(BioRuler，美國，批號：r5703)，D(+)-無水葡萄糖試劑盒(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20181205)。儀器：電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，型號：PL-203)、超聲細胞粉碎機(寧波新芝生物，型號：JY92-IIn)、臺式高速冷凍離心機(力康，中國香港，型號：Neofuge 15R)、渦旋混合器(武漢賽維爾生物科技有限公司，型號：MX-F)、全自動研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司，型號：KH-Ⅲ)、自動洗板機(深圳雷杜生命科技，型號:RT3100)、酶標檢測儀(BioTeK，德國，型號：EPoch)、全自動生化分析儀(深圳雷杜生命科技，型號：Chemray240)。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥品制備 十味消渴膠囊灌胃藥制備：拆去膠囊外殼，稱取適量藥物粉末，放入燒杯中，根據大鼠灌胃量(1 mL/100 g)加入適量蒸餾水，攪拌至完全溶解均勻。灌胃用葡萄糖溶液制備：取適量葡萄糖，放于燒杯中，根據大鼠灌胃量(2.5 g/kg)加入適量無菌水，攪拌混合均勻，直至葡萄糖完全溶解。注射用T4混懸液制備：取適量L-甲狀腺素鈉，放于燒杯中，根據大鼠注射劑量(0.2 mg/kg)加入蒸餾水，搖晃均勻即得。

1.2.2 分組及給藥 雄性SD大鼠45只，體質量(160±20)g，適應性喂養5 d后，禁食過12 h后，使用便攜式血糖測定儀取尾靜脈血測量血糖值，測定灌胃葡萄糖前(即0 h)血糖值，再測定灌胃2.5 g/kg BW葡萄糖后0.5 h、2 h血糖值，作為該批次動物基礎值[9]。以0 h、0.5 h血糖水平分為3個組，即空白組、模型組、陽性組(十味消渴膠囊1.32 g/(kg·d)，相當于人7.92 g/d)、每籠飼養6只。從實驗開始第一天給每組動物進行預防給藥，灌胃時間連續33 d(給藥體積：1 mL/100 g)。空白組不做處理，模型組給予同體積溶劑，陽性組予以灌胃十味消渴膠囊溶液。

1.2.3 造模方法 參考《保健食品檢驗與評價技術規范2003》輔助降血糖功能評價方法中的胰島素抵抗糖脂代謝紊亂模型，建立由高脂飼料喂養、勞倦傷脾、T4皮下注射、聯合鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)注射造成氣陰兩虛型胰島素抵抗糖脂代謝紊亂大鼠模型[9]。適應性喂養5 d后，開始造模，造模周期維持33 d：1)各組給予維持料飼養，1周后模型組、陽性組更換高熱能飼料，喂飼3周。2)負重游泳力竭運動：在實驗8～21 d灌胃給藥結束1 h后進行負重力竭游泳，在大鼠尾根部負荷其體質量10%的鉛塊，放入0.8 m×0.8 m×1 m的游泳桶內，水深0.7 m，水溫(20±5)℃，使大鼠在水中不能用尾巴接觸桶底，每桶放置2只。力竭標準：游泳動作明顯失調，不能再堅持；大鼠鼻尖沒入水里超過3 s不能回到水面，停止游泳，及時撈出，吹干毛發。3)T4皮下注射：在實驗22～28 d下午14：00進行上頸部皮下注射T4混懸液(0.2 mg/kg)。4)在實驗第28天T4注射結束后，模型組、陽性組禁食24 h(不禁水)，在實驗第29天給予2% STZ溶液(30 mg/kg)一次性腹腔注射(現用現配，取適量STZ，錫紙避光于冰塊中保存，用0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在冰浴中配置溶液，pH=4.5)，以1 mL/100 g體質量的劑量進行注射。注射后繼續給予高熱量飼料喂飼5 d。

1.2.4 模型判定 實驗結束后，各組動物禁食12 h，檢測空腹血糖(Fasting Blood Glucose，FBG)、糖耐量、血清胰島素及TC、TG水平。測定FBG即給葡萄糖前(0 h)血糖值，陽性組給予十味消渴藥液，模型組給予同體積溶劑，空白組不做處理，15 min后各組灌胃葡萄糖2.5 g/kgBW，測定給葡萄糖后0.5 h、2 h的血糖值，模型組FBG值≥10 mmol/L或0.5 h、2 h任一時間點血糖升高或血糖曲線下面積(Area Under The Curve，AUC)升高，與空白組比較有顯著性差異，判定糖代謝紊亂模型成立[9]。模型組血清TC或TG明顯升高，與空白組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，判定脂代謝紊亂模型成立[9]。

1.2.5 檢測指標與方法

1.2.5.1 大鼠證候表征的觀察 大鼠造模前和造模后證候表征比較，即大鼠毛色、尿量、排便情況、自主活動的表現。運用電子稱，在實驗第33天給各組大鼠稱體質量。每日觀察記錄各組大鼠的肛溫、攝食量、飲水量、排尿量、排便量。

1.2.5.2 血糖測定及相關指數計算 用血糖試紙，按說明書操作，尾尖靜脈取血測FBG值。AUC=(0 h血糖+0.5 h血糖)×0.5/2+(2 h血糖+0.5 h血糖)×1.5/2；胰島素抵抗指數(Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance，HOMA-IR)=(FBG×FINS)/22.5；胰島B細胞功能指數(HOMA-β)=20×FINS/(FBG-3.5)；胰島素敏感指數(Insulin Sensitivity Index，ISI)=Ln(l/FINS×FBG)。

1.2.5.3 大鼠負重游泳力竭運動時間 實驗第34天早晨進行最后1次負重游泳力竭運動，記錄負重游泳時間。

1.2.5.4 臟器指數、血脂、環核苷酸等指標的檢測 實驗第33晚灌胃結束后禁食不禁水，于第34天早晨進行最后1次負重游泳力竭運動，30 min后處死動物并取材。巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，3 000 r/min、離心半徑2 cm環境下離心10 min，取上清液，4 ℃保存待測，取胸腺、脾臟并稱重，計算各組大鼠胸腺、脾臟指數，臟器指數=臟器重(g)/體質量(g)。采用比色法在全自動生化儀上測各組血清TC、TG、LDL、HDL。采用酶聯免疫吸附試驗法檢測血清T3、T4、FINS、cAMP和cGMP的含量，并計算cAMP/cGMP比值。

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀況比較 實驗期間觀察大鼠的狀態，力竭游泳結束后，大鼠懶動無力，便溏，爪色青紫。注射T4后，大鼠情緒出現躁動，毛發枯黃，易脫落，飲水量、進食量增加，舌紅，小便黃，大便稍變干。注射STZ后，毛發枯黃無光澤，易脫落，飲水量、進食量顯著增加，舌色鮮紅，小便多，大便干，色黑，呈現出氣陰兩虛的證候表征。給藥后，陽性組大鼠毛發光澤度增強，脫落減少，自主活動正常，舌色紅，爪色淡紅，大便干，色黑。

2.2 各組大鼠體質量比較 對實驗第1天和實驗第33天的大鼠體質量進行比較，實驗第33天，與空白組比較，模型組大鼠體質量顯著降低(P<0.01)。陽性組與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠體質量比較

2.3 各組大鼠FBG比較 給藥33 d后，與空白組比較，模型組大鼠FBG顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，陽性組大鼠FBG顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠FBG比較

2.4 各組大鼠飲水量、進食量、排尿量、排便量、肛溫比較 與空白組比較，模型組大鼠飲水量、進食量、排尿量、排便量、肛溫顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，陽性組能使大鼠飲水量、進食量、排尿量、排便量、肛溫降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠飲水量、進食量、排尿量、排便量、肛溫比較

2.5 各組大鼠糖耐量比較 與空白組比較，模型組大鼠AUC顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，陽性組大鼠AUC顯著降低(P<0.01)，差異有統計學意義。見表4。

表4 各組大鼠糖耐量及AUC比較

2.6 各組大鼠FINS比較 與空白組比較，模型組大鼠FINS顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。陽性組大鼠FINS顯著升高，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。見表5。

表5 各組大鼠FINS比較

2.7 各組大鼠HOMA-IR、HOMA-β、ISI比較 與空白組比較，模型組大鼠HOMA-IR顯著升高，HOMA-β、ISI顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，陽性組大鼠HOMA-IR顯著降低，HOMA-β、ISI顯著升高(P<0.01)，差異有統計學意義。見表6。

表6 各組大鼠HOMA-IR、HOMA-β、ISI比較

2.8 各組大鼠血脂四項比較 與空白組比較，模型組大鼠TC、TG、LDL顯著升高，HDL顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，陽性組大鼠TC、TG、LDL顯著降低(P<0.01)，HDL顯著升高，差異有統計學意義。見表7。

表7 各組大鼠血脂四項比較

2.9 各組大鼠T3、T4比較 與空白組比較，模型組大鼠T3、T4顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，陽性組大鼠T3有下降趨勢，T4顯著降低(P<0.01)。見表8。

表8 各組大鼠T3、T4比較

2.10 各組大鼠cAMP、cGMP的影響 與空白組比較，模型組大鼠cAMP顯著升高、cGMP顯著降低、cAMP/cGMP顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，陽性組大鼠cAMP顯著降低、cGMP顯著升高、cAMP/cGMP顯著降低(P<0.01，P<0.05)。見表9。

表9 各組大鼠cAMP、cGMP、cAMP/cGMP的影響

2.11 各組大鼠脾臟、胸腺指數比較 與空白組比較，模型組大鼠脾臟指數、胸腺指數顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，陽性組大鼠脾臟指數、胸腺指數顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。見表10。

表10 各組大鼠脾臟、胸腺指數比較

2.12 各組大鼠力竭游泳時間比較 與空白組比較，模型組大鼠力竭游泳時間顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。陽性組能延長大鼠力竭游泳時間，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表11。

表11 各組大鼠力竭游泳時間比較

3 討論

針對目前保健食品功能評價方法缺少中醫功效評價，不能體現證候特點的問題，要實現辨證保健，就要先建立高血糖的證候模型。而糖尿病中醫證候動物模型的建立周期較長，6～10周才能造成氣陰兩虛證，且模型的動物狀態損傷較重，并不適合保健食品的功能評價，所以建立合適的中藥類保健食品的降血糖功能評價方法至關重要[12]。本研究基于此，擬在2012年版輔助降血糖功能評價方法的基礎上，結合中醫對消渴癥前期未病階段的認識，建立氣陰兩虛型胰島素抵抗糖脂代謝紊亂動物模型，探索適合中藥保健食品辨證保健的輔助降血糖的評價方法[9]。

3.1 氣陰兩虛型胰島素抵抗糖脂代謝紊亂模型造模方法的依據 糖尿病前期歸于中醫“脾癉”范疇，主要由肺、脾、腎臟腑功能失調所致，但其根源在于脾胃功能受損。中醫干預治療時應注重辨證，首先應辨虛實：實證以濕熱蘊脾、肝郁氣滯為主，虛證以脾虛濕盛、氣陰兩虛為主。氣陰兩虛證是一種介于氣虛和陰虛之間的復合證候，即氣虛與陰虛的表現同時并見[13]。氣虛，則體力下降，倦怠懶動，乏力懶言；陰虛，則五心煩熱，咽干顴紅，形體消瘦[14]。本實驗采用比較經典的中醫氣虛證和陰虛證的造模方法，即強迫大鼠進行負重力竭游泳2周模擬中醫勞倦傷脾所致氣虛，并甲狀腺素注射1周造成甲亢型陰虛，同時參考國家食品藥品監督管理局2012年發布的《輔助降血糖功能評價方法》中糖脂代謝紊亂模型造模方法，即高脂喂養結合STZ注射，造模周期共33 d，建立多因素復合、病證結合、適合辨證保健的“氣陰兩虛型高血糖動物模型”[9，15-16]。

3.2 氣陰兩虛型胰島素抵抗糖脂代謝紊亂模型大鼠血糖、血脂、胰島素比較 實驗結果表明，模型組大鼠FBG平均值為15.68 mmol/L，且0.5 h、2 h的血糖升高、血糖曲線下面積與空白組比較，均有顯著性差異，判定糖代謝紊亂模型成立。模型組大鼠血清TC、TG、LDL顯著升高，HDL顯著降低，與空白組比較有顯著性差異，判定脂代謝紊亂模型成立。同時，與空白組比較，模型組大鼠血清FINS顯著降低，HOMA-IR顯著升高，ISI、HOMA-β顯著下降，說明模型組大鼠處于胰島素抵抗狀態。根據以上結果判斷胰島素抵抗糖脂代謝紊亂模型復制成功。

3.3 氣陰兩虛型胰島素抵抗糖脂代謝紊亂模型大鼠中醫證候表征比較 在本實驗中，與空白組比較，模型組大鼠出現多飲、多食、多尿的“三多一少”癥狀，飲食量、飲水量、排尿量都顯著升高，肛溫也明顯升高，能食，精神不振，毛發枯黃，無光澤，易脫落，體質量下降，舌色淡紅等癥狀，與臨床上氣陰兩虛證的癥狀相符，說明模型大鼠表現出氣陰兩虛證的證候表證。

cAMP與cGMP對細胞反應具有拮抗性的調節作用，與中醫“陰”和“陽”的特點相似。測定血漿cAMP、cGMP水平及其比值，可以作為幫助判斷臨床辨證陰虛、陽虛的客觀指標[17]。研究認為cAMP/cGMP升高說明機體處于一種陰虛狀態[18]。T3、T4作為下甲狀旁腺功能亢進軸中甲狀腺分泌的關鍵激素，具有調節機體產熱和能量代謝的作用，研究顯示陰虛患者血清中T3、T4明顯升高，T3、T4可能是陰虛證的證候指標之一[19]。有研究認為T3、T4可作為陰虛內熱型糖尿病的證候指標[20-21]。在本實驗中，模型組大鼠cAMP升高而cGMP降低，cAMP/cGMP比值顯著升高，T3、T4顯著升高，表明本實驗模型組大鼠出現陰虛證候。

脾氣虛則機體運化失常，線粒體能量代謝損傷，氧化磷酸化產生的ATP減少，產能減少，推動機體生命活動的能力下降，引起免疫器官萎縮，導致免疫功能低下，血清細胞因子水平降低[22-23]。在本實驗中，模型組大鼠的脾臟指數、胸腺指數均顯著降低，且模型組大鼠力竭游泳時間明顯縮短，顯示其耐力也明顯下降，說明本實驗模型組大鼠處于氣虛證的狀態。

3.4 以方測證 “以方測證”是依據“方證相應”理論，根據方劑的藥物組成及效用，來推測其所治療對象的病機或癥狀的方法[24]。以方測證作為一種中醫認識病證的手段，一直是中醫臨床和基礎研究中的重要方法之一[25]。以相應的方劑干預不同階段的證，可使疾病的治療更為精確，證和方是密不可分的[26]。在中醫“證”的實驗研究中，建立穩定的某一證候模型，再用相對應的基本方藥進行干預，如果能改善或消除模型的癥狀和某些檢測指標，則可佐證此模型成立[27-29]。

由于目前已上市的中藥保健產品只有保健功能，沒有證候的概念，不能作為陽性藥物。故本實驗以治療消渴病氣陰兩虛證的十味消渴膠囊為陽性藥物。十味消渴膠囊是已經上市的降糖中藥復方制劑，由人參、黃芪、白術、山藥、玉竹、熟地黃、麥冬、牛膝、茯苓、澤瀉等藥味組成，功能是益氣養陰，生津止渴，主治消渴病氣陰兩虛證[30]。實驗結果顯示，十味消渴膠囊能顯著增加氣陰兩虛型高血糖大鼠體質量，降低FBG，改善糖耐量，延長力竭游泳時間，提高機體耐力，降低血清中T3、T4的水平，降低環核苷酸系統cAMP、cAMP/cGMP比值，升高HDL含量，降低LDL、TG、TC的水平，提高血清中胰島素含量，改善胰島素抵抗，以及改善大鼠的氣陰兩虛證候的狀態。十味消渴膠囊對模型大鼠各個指標都具有改善作用，以方測證，也佐證了本研究建立的氣陰兩虛型高血糖大鼠模型符合中醫理論，與相應的中醫證候一致，說明該造模方法是切實可行的。

本研究基于辨證保健的理念，根據中醫對糖尿病前期氣陰兩虛證的認識，在保健食品《輔助降血糖功能評價方法》(2012年)的基礎上，即高脂喂養結合STZ注射，造模周期共33 d，疊加力竭游泳和T4注射，建立多因素復合的病證結合“氣陰兩虛型高血糖動物模型”，造模設計在思路和方法上符合中醫基本理論，且造模周期較短。判定指標在《輔助降血糖功能評價方法》(2012年)的基礎上增加了中醫氣陰兩虛證候的表證和指標，既能評價輔助降血糖的功能，又能評價益氣養陰的中醫功效，體現了中藥保健食品辨證保健的特點。希望能在此模型的基礎上，研究相應保健產品的干預作用，進一步驗證輔助降血糖功能評價方法的可行性，為建立具有中醫辨證特點的保健食品功能評價方法提供科學依據，以期在科學的評價方法基礎上研發辨證保健食品，真正實現辨證保健，精準保健。