摩羅丹(濃縮丸)對慢性非萎縮性胃炎模型大鼠的影響

于澤玥 郝莉雨 陳紅映 李宗源 孫建輝 霍海如 李洪梅

(中國中醫科學院中藥研究所，北京，100700)

慢性非萎縮性胃炎(Chronic Non-Atrophic Gastritis，CNAG)是臨床常見胃部疾病，目前尚無特效療法[1]。CNAG是由各種因素聯合誘發的慢性胃黏膜炎性疾病，其中幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori，Hp)超標是其主要誘因之一。CNAG患者胃黏膜層以淋巴細胞和漿細胞浸潤為主，其致病機制主要為防御因子和/或攻擊因子失衡[2]。如若不盡早介入治療，后期極有可能會出現胃穿孔、胃潰瘍、胃出血等癥狀，進而發展為萎縮性胃炎，甚至胃癌，危及生命。摩羅丹(濃縮丸)是由百合、茯苓、玄參、烏藥、麥冬、澤瀉、當歸、茵陳、白術、白芍、石斛、九節菖蒲、三七、川芎、地榆、蒲黃、延胡索、雞內金等18味中藥飲片組成的中藥制劑，其中百合可以養津護胃，烏藥可以促進消化液分泌，雞內金能提高胃液分泌量、酸度、促進胃排空和防止膽汁反流，三七可止血、減輕胃黏膜炎癥，當歸具有抑菌作用，白術和茯苓可提高機體免疫功能，茵陳可利膽，川芎、延胡索具有行氣止痛的作用[3-4]。多味藥合用，具有和胃健脾、理氣消脹、通絡止痛的功效。臨床上常將其用于治療各種胃部疾病，如慢性胃炎、萎縮性胃炎等。本項研究通過觀察摩羅丹對CNAG大鼠胃黏膜損傷的修復情況，和對血清胃動素、胃泌素的含量影響，以及胃液pH值、胃蛋白酶含量來評價摩羅丹對CNAG大鼠胃黏膜的保護及修復作用，闡明其相關藥理機制，為摩羅丹在CNAG方面的作用提供藥效學研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級SD大鼠，80只，體質量180～220 g，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0006。大鼠飼養在中國中醫科學院屏障環境下，溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，明暗交替12/12 h。實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2019-0003。本研究所涉及動物實驗通過中國中醫科學院中藥研究所動物福利倫理委員會審批(倫理審批號：2020B025)。

1.1.2 藥物 摩羅丹(濃縮丸)(邯鄲制藥股份有限公司，生產批號：S00518003)；枸櫞酸鉍鉀顆粒(麗珠集團麗珠制藥廠，生產批號：2003034)。

1.1.3 試劑與儀器 無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，生產批號：20181210)；氨水(北京化工廠，生產批號：20180808)；甲醛(天津市大茂化學試劑廠，生產批號：20171111);水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司，生產批號：20130201)；去氧膽酸鈉[西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，美國，生產批號：#SLCC4936]；胃泌素(Gastrin)ELISA Kit試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，生產批號：L200724640)；胃動素(Motilin)ELISA Kit試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，生產批號：L200724647)；0.9%氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司，生產批號：1908263201)；電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，型號：Sartorius BSA323S-CW]；電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號：PL203 METTLER TOLEDO]；pH計[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號：FE20]；酶標儀(伯騰儀器有限公司，美國，型號：Bio Tek Epoch)；自動脫水機(徠卡公司，德國，型號：TP1020)；石蠟包埋機(徠卡公司，德國，型號：EG1140H)；生物顯微鏡(徠卡公司，德國，型號：DM2500)；全自動輪轉式切片機(美康公司，德國，型號：HM355S)；自動染色機(徠卡公司，德國，型號：XL5010)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選取健康SPF級80只SD大鼠，體質量180～220 g，雌雄各半，按體質量隨機選取12只大鼠作為正常大鼠，其余大鼠制備CNAG模型[5]。除正常組外，造模大鼠空腹灌胃60%乙醇溶液，每周2次(周二、周五)，每日在非空腹狀態下灌胃20 mmol/L的去氧膽酸鈉溶液。第1～6周，以0.05%氨水作為大鼠飲用水，自由飲用；第7～12周，以0.1%氨水作為大鼠飲用水，自由飲用；且采用2 d足量喂食，1 d禁食(周一、周四)，連續造模12周；正常對照組動物不限食物，自由飲用純凈水。于第8周時，隨機從正常大鼠中取2只大鼠，從造模動物中取8只大鼠，雌雄各半，取胃，進行組織病理學檢查，待慢性胃炎模型復制成功后，再按體質量隨機分為5組，即模型組、枸櫞酸鉍鉀顆粒組，摩羅丹(濃縮丸)高劑量、中劑量、低劑量組，每組12只，雌雄各半，繼續造模12周

1.2.2 給藥方法 各組分別灌胃枸櫞酸鉍鉀顆粒(0.72 g/kg，臨床等效劑量的2倍)、摩羅丹(濃縮丸)高劑量、中劑量、低劑量(1.00 g/kg、0.50 g/kg、0.25 g/kg，臨床等效劑量的0.5、1、2倍)，灌胃正常組與模型組等體積純凈水，1次/d，連續4周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 一般生理狀況和體質量 觀察大鼠一般生理狀況(精神、攝食量、毛發、行為)和體質量變化，記錄大鼠給藥前與給藥后每周的體質量。

1.2.3.2 標本采集 末次給藥后，各組大鼠禁食16 h，實驗當天所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，打開腹腔，并結扎幽門下0.3 cm處，縫合腹腔。待5 h后，將大鼠麻醉，腹主動脈取血，靜置2 h后，離心半徑16.7 cm，3 500 r/min,離心15 min，分離血清，于-80 ℃冰箱保存；剪開結扎處收集胃液，3 000 r/min,離心15 min，取上清液待測。

1.2.3.3 胃黏膜組織病理學檢查 取出胃，收集胃液后，沿胃大彎剪開，用冰生理鹽水沖洗，并迅速置于10%甲醛中固定24 h。24 h后取出流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，切片3.5 μm，蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、照相。光學顯微鏡下觀察大鼠胃的病理形態學改變，進行組間比較。

1.2.3.4 胃液pH和胃蛋白酶活性測定 取胃液上清液，用pH計測定其pH值。并按試劑盒說明書測定胃蛋白酶活性。

1.2.3.5 血清胃動素、胃泌素測定 取血清，按照酶聯免疫吸附試驗說明書測定血清中胃動素、胃泌素的含量。

2 結果

2.1 摩羅丹對大鼠一般狀況和體質量的影響 實驗過程中，正常組大鼠精神狀態良好，動作敏捷，攝食正常，被毛無明顯脫落。造模期間，與正常組比較，造模大鼠精神萎靡，懶食少動，蜷縮，攝食量減少，體質量呈降低趨勢。給藥期間，與模型組動物比較，各給藥組動物精神狀態及活動狀態變好，攝食量增加，體質量未見明顯差異。見圖1～2。

圖1 摩羅丹對雄性大鼠體質量影響

圖2 摩羅丹對雌性大鼠體質量影響

2.2 摩羅丹對胃組織病理形態學的影響 正常組大鼠胃黏膜未見有充血、水腫，淺層黏膜未見有脫落，黏膜下肌層未見有水腫，血管未見有充血，組織結構正常。模型組可見胃黏膜大面積、階段性脫落，黏液滲出較多，脫落的黏膜內有淋巴細胞、少量漿細胞滲出，并有嗜酸性細胞出現，黏膜炎癥細胞浸潤，黏膜下肌層充血、淤血，間質充血水腫，組織明顯水腫。與模型組比較，枸櫞酸鉍鉀顆粒組、摩羅丹(濃縮丸)高劑量、中劑量、低劑量組大鼠胃黏膜僅有少量脫落，炎癥細胞浸潤、間質滲出和水腫、肌層充血和淤血，以及腺細胞嗜酸性變等病變癥狀均有不同程度的減輕。通過對病理學情況進行半定量統計，經秩和檢驗，得出正常組、各給藥組與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1，圖3。

表1 摩羅丹對CNAG組織形態學的影響方法

病理學判斷標準與分級標準：1)“-”：大鼠胃黏膜未見有水腫、滲出，黏膜未見有脫落，黏膜下肌層未見有水腫，血管內未見有明顯充血，結構正常；2)“+”：大鼠胃黏膜未見明顯水腫，有輕度充血、滲出，小片狀病變，有個別腺細胞輕度水腫，肌層有少量嗜酸性細胞滲出，未見有明顯組織水腫；3)“++”：大鼠胃黏膜有小面積水腫、充血，黏膜淺層有節段性脫落，有少部分腺細胞有水腫、嗜酸樣變，細胞個體較大，胞質被染成粉色。肌層有少量炎癥、充血，組織輕度水腫；4)“+++”：大鼠胃黏膜淺層有脫落，黏膜間質有充血、滲出性黏液及水腫；部分胃腺細胞腫大，胞質粉染，黏膜層有淋巴細胞、漿細胞滲出，黏膜下肌層有大量嗜酸性細胞浸潤及少量漿細胞滲出，肌層組織有大面積水腫，血管內淤血、充血較嚴重；5)“++++”：大鼠胃黏膜有大面積節段性脫落，淺層較重，黏液較多，脫落的黏膜內有少量淋巴細胞、漿細胞滲出，并有少量嗜酸性細胞；胃黏膜間質有水腫，黏膜上層有部分腺細胞腫大；黏膜下肌層有大面積充血、淤血，嗜酸性細胞浸潤，組織水腫。

2.3 摩羅丹對胃液pH和胃蛋白酶活性的影響 模型組大鼠較正常組大鼠胃蛋白酶含量有所下降，胃液pH值顯著降低(P<0.05)。各給藥組較模型組胃液pH值、胃蛋白酶含量有不同程度的升高。其中，摩羅丹(濃縮丸)高劑量組、枸櫞酸鉍鉀顆粒組與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4～5。

圖3 各組大鼠胃黏膜組織病理學結果(HE染色，×200)

圖4 各組胃液pH值

圖5 各組胃液胃蛋白酶含量

2.4 摩羅丹對血清胃動素、胃泌素含量的影響 模型組較正常組胃泌素含量上升，胃動素含量下降。各給藥組較模型組胃動素含量有不同程度的上升，胃泌素含量有不同程度的下降。其中，摩羅丹中劑量組、低劑量組胃動素表達水平與模型組差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。見圖6～7。

圖6 各組胃泌素含量

圖7 各組胃動素含量

3 討論

中醫學將CNAG歸屬于“胃痛”“嘈雜”“胃痞”等病證范疇[6]。中成藥干預是我國CNAG治療的重要組成部分，一項發表于2017年的《慢性非萎縮性胃炎中西醫結合診療共識意見》中將香砂六君丸、三九胃泰顆粒等11種中成藥作為治療慢性萎縮性胃炎的推薦藥物[7]。目前，已有研究證明摩羅丹對萎縮性胃炎、慢性胃炎有顯著的治療效果[8-12]。摩羅丹能夠顯著降低萎縮性胃炎患者表皮生長因子及其受體的表達，以調節胃黏膜細胞的增殖、分化，調節胃酸分泌，修復胃黏膜；摩羅丹與常規西藥合用(如莫法替丁、奧美拉唑等)治療萎縮性胃炎見效更快；摩羅丹與葉酸、維生素E聯用，可以治療萎縮性胃炎，甚至逆轉輕、中度胃上皮內瘤病情的進展。且摩羅丹治療慢性胃炎的急性毒性和長期毒性實驗證明其安全有效，無不良反應[13]。截止到目前，在國家不良反應監測中心未出現任何藥物不良反應報告。本實驗主要研究摩羅丹對CNAG的治療作用，為摩羅丹在非萎縮性胃炎方面的藥效學研究提供實驗依據。

CNAG的主要癥狀為胃黏膜損傷，在動物實驗中，CNAG模型大鼠常采用饑飽失常、低濃度氨水溶液與水楊酸鈉溶液或去氧膽酸鈉溶液聯合制備[14-16]。本實驗采用饑飽失常法聯合低濃度氨水溶液、去氧膽酸鈉溶液，使大鼠胃防御屏障與刺激因素失衡，模擬Hp感染狀態下高濃度的氨對胃黏膜的毒性損害，進而引起慢性或急性炎癥損傷，來制備CNAG鼠模型，且其表現與臨床癥狀相似。模型組胃黏膜病理檢查結果顯示胃黏膜大面積脫落，脫落的黏膜內有淋巴細胞、少量漿細胞滲出，并有嗜酸性細胞出現，黏膜下肌層充血、淤血，組織水腫等，與正常組胃組織病理學結果差異有統計學意義(P<0.01)，提示本實驗CNAG大鼠模型制備成功。

CNAG大鼠分別經過摩羅丹(濃縮丸)高劑量、中劑量、低劑量治療后，病理結果顯示與模型組大鼠比較，各給藥組胃黏膜組織均有不同程度的改善和修復(P<0.01)，提示摩羅丹(濃縮丸)可以保護和修復CNAG的胃黏膜組織，摩羅丹(濃縮丸)高劑量、中劑量、低3個劑量組與2倍臨床等效劑量的陽性對照藥治療效果相當。此外，胃酸pH過低會引起空腹胃痛、損傷胃黏膜組織[17]。本實驗結果顯示摩羅丹(濃縮丸)可以通過恢復CNAG模型大鼠胃液pH值至正常水平來維持、保護胃黏膜組織。但此次給藥組相較于模型組胃液中胃蛋白酶的含量差異無統計學意義。

胃動素又名腦-腸肽激素，對胃腸運動與胃腸電活動都有較大影響。胃動素可刺激胃蛋白酶的分泌，使胃黏膜血流量增加，維持胃酸pH值正常水平，對胃組織不同區域的肌細胞有明顯的收縮作用[18-19]。故而胃動素釋放含量降低時，胃蠕動能力下降，胃酸pH值易失衡。胃泌素主要由胃竇部G細胞合成，其主要生物學功能包括：促進胃黏膜上皮細胞生長、增殖和分化，刺激胃酸分泌，促進胃黏膜修復等，但當其分泌過多時，會損傷胃黏膜組織[20]。本實驗中，模型組大鼠血清胃動素含量較正常組下降，枸櫞酸鉍鉀顆粒組、摩羅丹高劑量、中劑量、低劑量組大鼠胃動素含量有不同程度的上升，其中摩羅丹中劑量組和低劑量組較模型組差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，這提示摩羅丹(濃縮丸)治療CNAG可能與調節胃動素的分泌有關。本次實驗中，各給藥組血清胃泌素含量與模型組比較，未見明顯差異。

綜上所述，摩羅丹(濃縮丸)能夠減輕CNAG大鼠的胃黏膜損傷，其作用機制可能與維持胃液pH值，調節胃動素的分泌的有關，表明摩羅丹(濃縮丸)對CNAG有較好的治療作用，并對胃黏膜有修復損傷和保護作用。