皮膚黑色素瘤中SKA3表達及潛在分子機制分析

張鳳友，羅文奇，陳肖瑜，杜春平，黨裔武

皮膚黑色素瘤(skin cutaneous melanoma, SKCM)是起源于黑色素細胞的惡性腫瘤，其具有高度侵襲性、早期易轉(zhuǎn)移等特點，導致SKCM患者預后不佳和病死率高[1]。因此，SKCM的早期診斷和治療尤為重要。紡錘體與著絲粒相關(guān)蛋白3(spindle and kinetochore associated complex subunit 3, SKA3)是SKA蛋白家族的重要成員之一，其主要通過調(diào)節(jié)微管結(jié)合因子來維持有絲分裂期間染色體的精確分離，確保有絲分裂的生物學進程[2]。研究表明SKA3與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，SKA3過表達可促進腫瘤細胞的增殖和侵襲，是預后不良的預測因素，其在乳頭狀甲狀腺癌[3]、乳腺癌[4]、肺癌[5]、肝癌[6]等腫瘤中高表達。目前，關(guān)于SKA3在SKCM中的文獻報道甚少。本文通過免疫組化法及公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析SKA3在SKCM中的表達、對預后的影響及其潛在分子機制，為進一步研究SKA3在SKCM中的診療、發(fā)生發(fā)展的作用機制提供線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年1月～2021年2月廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院存檔的43例SKCM根治性手術(shù)標本及其配對的正常皮膚標本，患者術(shù)前均未行放、化療或分子靶向治療。本實驗經(jīng)廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化SP 9000法染色，SKA3抗體(稀釋比1 ∶400，bs-7848R，北京Bioss公司)。結(jié)果判讀：(1)按陽性細胞百分比計分：陽性細胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。(2)按陽性細胞百分比計分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結(jié)果相乘：0～3分為陰性，4～12分為陽性。

1.2.2公共數(shù)據(jù)提取 從基因芯片表達數(shù)據(jù)庫(GEO)獲得SKCM組織中SKA3基因芯片的表達數(shù)據(jù)。篩選出3個數(shù)據(jù)集信息如下：GSE114445(16例SKCM和11例正常皮膚組織樣本)、GSE7553(82例SKCM和4例正常皮膚組織樣本)及GSE15605(58例SKCM和16例正常皮膚組織樣本)。

1.2.3數(shù)據(jù)分析 GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)是基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的腫瘤和正常樣本進行基因表達的在線分析網(wǎng)站。GEPIA在線數(shù)據(jù)分析SKA3 mRNA在SKCM和正常對照組織中的表達差異。利用Linkedomics(http://www.linkedomics.org/login.php)在線數(shù)據(jù)網(wǎng)站篩選SKA3基因的共表達基因。DAVID(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)數(shù)據(jù)庫對SKA3基因的共表達基因進行GO基因富集分析和KEGG通路富集分析。String(https://string-db.org/)在線蛋白互作分析軟件分析SKA3蛋白上下游的關(guān)系。TISIDB(http://cis.hku.hk/TISIDB/)軟件分析472例SKCM組織的RNA測序數(shù)據(jù)，分析SKA3表達與活化CD4+T細胞、不成熟B細胞、肥大細胞、Ⅰ型輔助T細胞以及效應(yīng)記憶CD8+T細胞的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。χ2檢驗分析SKA3蛋白表達與SKCM臨床病理特征的相關(guān)性。單因素方差分析TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中SKA3 mRNA在SKCM組和正常對照組間的差異。獨立樣本t檢驗分析SKA3 mRNA表達在GEO高通量芯片表達數(shù)據(jù)集腫瘤組和正常對照組間的差異。Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗比較SKA3高表達組和低表達組間的總生存期和無瘤生存期。Spearman相關(guān)分析篩選與SKA3共表達的基因，篩選標準為：P<0.05，r>0.4或<-0.4。Spearman法分析SKA3表達與免疫細胞浸潤的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫分析SKA3 mRNA在SKCM組織中的表達及其與患者預后的關(guān)系GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示，與正常對照組相比，SKA3 mRNA在SKCM組織中明顯高表達，差異有統(tǒng)計學意義(TPM中位數(shù)值：SKCM組=4.840，正常組=0.620，P<0.05，圖1)。通過GEPIA在線分析網(wǎng)站分析SKA3 mRNA與SKCM患者預后的關(guān)系，其中SKA3 mRNA高表達組與低表達組樣本各229例，生存分析結(jié)果提示，SKA3 mRNA高表達組SKCM患者的總生存期和無瘤生存期均顯著短于低表達組，差異均有統(tǒng)計學意義(總生存期：HR=1.3，P=0.035；無瘤生存期：HR=1.3，P=0.018，圖2)。

圖1 TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫分析SKA3 mRNA在SKCM組織中的表達：TPM.每百條讀數(shù)轉(zhuǎn)錄本；*P<0.05

圖2 SKA3 mRNA表達與SKCM患者預后的關(guān)系：A.總生存期；B.無瘤生存期

2.2 GEO數(shù)據(jù)庫分析SKA3 mRNA在SKCM組織中的表達利用GSE114445、GSE7553、GSE15605三個數(shù)據(jù)集分析SKA3 mRNA在SKCM和正常對照組織間的表達差異。與正常組織(GSE114445：4.814；GSE7553：6.656；GSE15605：4.940)相比，SKA3 mRNA在SKCM中的表達均上調(diào)(GSE114445：5.119；GSE7553：8.473；GSE15605：6.059)，差異有統(tǒng)計學意義(圖3)。

圖3 GEO數(shù)據(jù)庫分析SKA3 mRNA在SKCM中的表達

2.3 SKCM中SKA3蛋白表達及與臨床病理特征的關(guān)系免疫組化法檢測43例SKCM組織和配對正常皮膚石蠟組織中SKA3蛋白表達，結(jié)果顯示SKA3蛋白在SKCM組織中的陽性率(55.81%)高于正常皮膚組織(2.33%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，圖4)。SKA3蛋白表達水平與公共數(shù)據(jù)庫中SKA3 mRNA表達水平一致。χ2檢驗分析顯示，SKA3表達與患者年齡(P=0.018)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.004)、脈管內(nèi)癌栓(P=0.034)相關(guān)，與患者性別、腫物直徑、Breslow厚度、Clark分期、神經(jīng)侵犯無關(guān)(P>0.05，表1)。

AB

表1 SKA3表達與SKCM臨床病理特征的關(guān)系

2.4 SKA3共表達基因的功能富集分析Linkedomics數(shù)據(jù)庫中篩選獲得SKA3的共表達基因396個，其中呈正相關(guān)者有358個(P<0.05，r>0.4)，呈負相關(guān)者有38個(P<0.05，r<-0.40)。GO基因富集發(fā)現(xiàn)，SKA3基因編碼的蛋白主要定位于細胞質(zhì)、紡錘體極、中心體、著絲點等上面；分子功能主要有蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、DNA結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合等；而生物學過程主要集中于細胞分裂、有絲分裂、姐妹染色單體凝聚力、DNA復制等。KEGG信號通路主要為細胞周期、DNA復制、卵母細胞減數(shù)分裂、p53信號通路等。

2.5 SKA3基因的上下游相關(guān)基因用String網(wǎng)站分析SKA3基因上下游相關(guān)基因的關(guān)系，得到相應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)。PPI富集P值=1.0e-16，相互作用節(jié)點數(shù)10個，分別為SKA1、SKA2、BUB1B、CCNB1、SPDL1、BUB1、BOD1、NDC80、PLK1、CENPE。其中SKA1、SKA2及BUB1B蛋白與SKA3蛋白聯(lián)系最為密切(Score=0.99)。

圖5 SKA3基因與上下游基因的調(diào)控關(guān)系

2.6 SKA3與腫瘤免疫細胞浸潤的關(guān)系SKA3與活化CD4+T細胞的免疫浸潤水平呈正相關(guān)(r=0.386，P<2.2e-16)，與不成熟B細胞(r=-0.255，P=2.06e-08)、肥大細胞(r=-0.248，P=5.2e-08)、Ⅰ型輔助T細胞(r=-0.256，P=1.87e-08)以及效應(yīng)記憶CD8+T細胞(r=-0.246，P=6.58e-08)的免疫浸潤水平呈負相關(guān)(圖6)。

圖6 SKA3與腫瘤免疫細胞浸潤的關(guān)系：A.SKA3與活化CD4+T細胞的免疫浸潤水平呈正相關(guān)；B.SKA3與不成熟B細胞免疫浸潤水平呈負相關(guān)；C.SKA3與肥大細胞免疫浸潤水平呈負相關(guān)；D.SKA3與Ⅰ型輔助T細胞免疫浸潤水平呈負相關(guān)；E.SKA3與效應(yīng)記憶CD8+T細胞的免疫浸潤水平呈負相關(guān)

3 討論

高度侵襲性和易早期遠處轉(zhuǎn)移是SKCM的特征，SKCM的早期診斷和治療對于延長患者生存周期至關(guān)重要[7]。腫瘤的發(fā)生與細胞異常分裂密切相關(guān)，在有絲分裂中細胞通過雙極紡錘體分裂成兩個相同的子細胞。在這個過程中，精確的染色體分離依賴于染色體與動態(tài)微管尖端之間的牢固連接，SKA3是微管結(jié)合調(diào)控的關(guān)鍵，通過調(diào)節(jié)微管結(jié)合因子來維持有絲分裂期間染色體的精確分離[2]。SKA3在多種腫瘤中均過表達，據(jù)文獻報道SKA3基因在肺腺癌中表達上調(diào)，與患者年齡、性別、病理分期、N分期和M分期顯著相關(guān)[5]。本組通過分析公共數(shù)據(jù)庫TCGA、GTEx中的SKCM數(shù)據(jù)集以及GEO高通量芯片GSE114445、GSE7553及GSE15605三組數(shù)據(jù)集，均發(fā)現(xiàn)SKA3 mRNA在SKCM組織中表達上調(diào)。為進一步驗證生物信息學結(jié)果，本組免疫組化結(jié)果顯示SKA3蛋白在SKCM中的表達明顯高于正常皮膚組織，且與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓相關(guān)，提示SKA3可能是SKCM發(fā)生、發(fā)展中的作用因子。SKA3高表達組患者的總生存期和無瘤生存期均低于低表達組，提示SKA3高表達患者的預后更差。以上5個不同數(shù)據(jù)集的結(jié)果均提示，SKA3表達與SKCM患者的預后顯著相關(guān)。

功能富集分析結(jié)果顯示，SKA3基因編碼的蛋白主要定位于細胞質(zhì)、紡錘體極、中心體、著絲點等上面；分子功能主要有蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、DNA結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合等；而生物學過程主要集中于細胞分裂、有絲分裂、姐妹染色單體凝聚力、DNA復制等。KEGG信號通路主要為細胞周期、DNA復制、卵母細胞減數(shù)分裂、p53信號通路等。研究表明，通過調(diào)控細胞周期依耐性激酶CDK2及p53蛋白磷酸化，SKA3可促進肝癌細胞的生長和遠處轉(zhuǎn)移[8]。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)，SKA3通過調(diào)節(jié)Akt/GSK-3β軸心激活Wnt/β-catenin信號通路，促進膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤細胞的增殖和侵襲。SKA3還可以作為miR-455-3p的靶基因參與調(diào)控腎透明細胞癌的惡性進展[10]。王亞等[11]研究發(fā)現(xiàn)SKA3在結(jié)直腸癌中高表達，敲減SAK3表達可抑制癌細胞的增殖和遷徙，這可能與抑制PI3K/Akt信號通路有關(guān)。同樣，Liang等[12]體外實驗也發(fā)現(xiàn)沉默SKA3可顯著抑制SKCM細胞的增殖、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，并誘導其細胞凋亡，沉默SKA3可降低PI3K和Akt的磷酸化水平，Akt抑制顯著逆轉(zhuǎn)SKA3過表達誘導的對SKCM細胞的致癌作用。以上證據(jù)提示，SKA3可能通過調(diào)控細胞周期和多種信號通路參與了惡性腫瘤的進展。本組前期實驗發(fā)現(xiàn)SKA3在甲狀腺乳頭狀癌的表達上調(diào)，且與患者預后和腫瘤的免疫細胞浸潤相關(guān)[3]。本實驗通過分析SKA3與腫瘤免疫細胞浸潤的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)SKA3與活化CD4+T細胞呈正相關(guān)，與不成熟B細胞、肥大細胞、Ⅰ型輔助T細胞以及效應(yīng)記憶CD8+T細胞呈負相關(guān)，這提示在SKCM中SKA3也可能與免疫細胞浸潤相關(guān)，為個體免疫治療提供了可能的分子靶點。然而SKA3促進腫瘤發(fā)生的分子機制仍需更深入的基礎(chǔ)實驗研究。

綜上所述，本實驗通過免疫組化染色結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫測序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，SKA3 mRNA和蛋白在SKCM中高表達。SKA3可能是SKCM的潛在診斷和預后分子標志物，對腫瘤發(fā)生、發(fā)展可能具有一定的促進作用，為SKCM患者的個體化治療提供新思路。