胰腺癌中黏附性G蛋白偶聯受體家族的表達及其臨床意義

張京城，徐 凱，王 成

胰腺癌惡性程度高、預后差，手術是根治胰腺癌的唯一辦法，但大多數患者因早期癥狀不典型、診斷滯后等原因而錯失最佳手術治療時機；以吉西他濱為代表的化療方案，雖能延長晚期患者的中位生存期，但患者5年生存率仍低于9%[1]。因此，尋找胰腺癌可靠的生物學標志物和有效的治療靶點，進一步探索分子調控機制，一直是胰腺癌領域的研究前沿。aGPCRs作為第二大類G蛋白偶聯受體家族，近來被發現在乳腺癌[2]、肺癌[3]、前列腺癌[4]等腫瘤中異常表達，其中一些受體與腫瘤的發展密切相關，但其在胰腺癌中的研究卻少有報道[5]。本實驗結合生物信息學分析與臨床樣本免疫組化染色，探討aGPCRs在胰腺癌中的表達及其臨床意義，挖掘潛在的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 生物信息學分析利用Oncomine(www.oncomine.org)、GEPIA2(http://gepia2.cancer-pku.cn/)數據庫尋找胰腺癌與正常胰腺組織之間在轉錄組水平廣泛差異表達的aGPCRs；利用K-M plotter(http://kmplot.com/)數據庫，通過選擇“Auto select best cutoff”和“OS”，獲得aGPCRs轉錄組表達水平與生存期之間Log-rank檢驗的P值、風險比和95%置信區間，分析差異表達aGPCRs轉錄組水平與胰腺癌患者預后的相關性。

1.2 臨床資料收集2016～2018年安徽省立醫院存檔的胰腺癌組織及其癌旁組織各58例，胰腺癌組織術后病理檢查均證實為胰腺導管腺癌，患者術前均未行放、化療，經術后隨訪獲取患者預后情況?；颊吣挲g41～80歲，平均(63.09±9.232)歲，其中男性37例，女性21例；腫瘤直徑>4 cm者20例，≤4 cm者38例；根據2018年美國AJCC臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期36例，Ⅲ+Ⅳ期22例；有淋巴結轉移者32例，無淋巴結轉移者26例；根據國際UICC組織分級：低分化30例，高+中等分化28例；有神經浸潤41例，無神經浸潤17例。

1.3 免疫組化利用臨床胰腺癌及其癌旁組織中mRNA水平廣泛差異表達且與患者預后相關的aGPCRs蛋白水平表達情況，采用免疫組化SP兩步法進行染色，抗原修復采用高壓蒸汽法，兔抗人ADGRA2、ADGRC3、ADGRF1、ADGRG6、ADGRE5、ADGRF4多克隆抗體購自博奧森生物公司，DAB顯色試劑盒及通用SP試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。以HPA(https://www.proteinatlas.org/)數據庫明確為陽性的標本作為陽性對照組，以PBS緩沖液作為陰性對照。

1.4 結果判斷染色結果由兩位病理醫師獨立評估。隨機選取5個高倍鏡視野，根據陽性細胞的百分比進行評分：≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%以上為3分；另根據陽性細胞著色強度進行評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最終將兩項評分相乘，其中≥6分歸為高表達組，<6分為低表達組。

1.5 統計學分析采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗分析蛋白表達與臨床病理特征的相關性；采用Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank檢驗分析目的蛋白表達與預后的相關性；采用Cox回歸模型進行單因素和多因素生存分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌中aGPCRs mRNA的表達Oncomine、GEPIA2數據庫檢測發現，胰腺癌組織中11個aGPCRs(ADGRE5、ADGRA2、ADGRC3、ADGRF1、ADGRF4、ADGRG1、ADGRG6、ADGRL4、ADGRF5、ADGRL2、ADGRE2)的mRNA廣泛高表達(P<0.05)。K-M plotter數據庫檢測發現，ADGRE5、ADGRF1、ADGRF4、ADGRG6 mRNA表達與患者預后呈負相關，ADGRA2、ADGRC3 mRNA表達與患者預后呈正相關(P<0.05)。結果提示ADGRE5、ADGRA2、ADGRC3、ADGRF1、ADGRF4、ADGRG6可作為胰腺癌預后的生物學標志物，可能是胰腺癌發生、發展的潛在因子(圖1)。

圖1 Oncomine數據庫(A)、GEPIA2數據庫(B)中aGPCRs mRNA表達水平及其與患者預后的相關性(C)：N.癌組織；T.正常組織

2.2 胰腺癌組織中ADGRF4、ADGRE5、ADGRC3蛋白表達免疫組化結果顯示，ADGRA2、ADGRF1在癌旁組織中的表達水平高于胰腺癌組織，差異無統計學意義；ADGRG6在癌旁組織及胰腺癌組織中均未見明顯表達；ADGRF4、ADGRE5、ADGRC3在胰腺癌組織中表達高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.01，圖2)。ADGRF4表達定位于細胞膜和細胞質，部分病例可見胞核強陽性，陽性率為84%(49/58)；ADGRE5表達定位于細胞質和細胞膜，陽性率達95%(55/58)；ADGRC3表達主要定位于細胞質，陽性率為52%(30/58)。

ADGRF4ADGRE5ADGRC3ADGRA2ADGRF1ADGRG6癌旁癌

2.3 ADGRF4、ADGRE5表達與胰腺癌臨床病理特征的關系統計分析顯示，ADGRC3表達與胰腺癌各項臨床病理特征均不相關；ADGRF4表達與患者年齡、性別、TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤分化程度無關，與腫瘤直徑、神經浸潤呈正相關(P<0.05)；ADGRE5表達與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、神經浸潤無關，與臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移呈正相關(P<0.05，表1)。

表1 ADGRF4、ADGRE5表達與胰腺癌臨床病理特征的關系

2.4 ADGRF4、ADGRE5蛋白表達與胰腺癌患者預后的相關性Kaplan-Meier生存分析結果顯示，ADGRF4、ADGRE5蛋白表達水平與患者預后呈負相關(P<0.01，圖3)。Cox單因素回歸分析顯示，TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移、ADGRF4表達、ADGRE5表達，均是胰腺癌患者預后的影響因素(P<0.05，表2)，Cox多因素分析結果顯示，TNM分期、腫瘤直徑、ADGRF4表達是胰腺癌患者預后的獨立影響因素(P<0.05，表2)。

圖3 Kaplan-Meier生存曲線分析ADGRF4(A)、ADGRE5(B)與胰腺癌患者預后的相關性

表2 Cox單因素及多因素分析胰腺癌患者預后相關因素

3 討論

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統腫瘤，在我國其發病率呈逐年升高趨勢，病死率位居惡性腫瘤的第7位[6]。GPCRs是最大的跨膜蛋白超家族，由于其結構的特殊性和功能的多樣化，全球約34%的靶向藥物針對GPCRs[7-8]，其在腫瘤中的研究具有巨大的潛在價值。aGPCRs因具有一個大的細胞外黏附結構域和七次跨膜結構域被命名，表現為細胞黏附功能和信號轉導功能[9]。也因其結構復雜，aGPCRs相關研究一直較少，半數以上受體仍為孤兒受體，未能找到特異性配體[10]。近年，aGPCRs參與惡性腫瘤增殖、轉移和腫瘤細胞間通訊的功能逐漸被發現[11-12]。

ADGRF4是ADGRF亞家族成員之一，又被命名為GPR115、PGR18。目前，關于ADGRF4的研究十分有限。2020年Chiba等[13]發現ADGRF4通過調控成釉細胞中CAR6的表達參與牙釉質的礦化過程。在腫瘤領域，有研究通過高通量測序技術發現，ADGRF4在甲狀腺癌、結腸癌中表達升高，但并未展開深入的實驗性研究[14-15]。本實驗通過生物信息學分析結合免疫組化染色首次探討ADGRF4在胰腺癌中的表達情況，發現ADGRF4在胰腺癌中高表達，是胰腺癌患者預后的獨立危險因素，其表達與腫瘤直徑、神經浸潤呈正相關。神經浸潤是指腫瘤細胞侵入神經或神經周圍。已往多項研究報道[16-17]，胰腺癌的神經浸潤率是所有惡性腫瘤中最高的，是胰腺癌的重要特征，也是胰腺癌侵襲性行為和預后不良的重要指標。ADGRF4是否通過影響神經浸潤發揮促癌作用，是下一步研究的方向。

ADGRE5是ADGRE亞家族成員之一，又被命名為TM7LN1、CD97，廣泛存在于淋巴細胞、單核細胞、粒細胞和平滑肌等細胞的表面[18]。目前關于ADGRE5在腫瘤中的研究相對較多，被發現在包括甲狀腺癌、胃癌、結腸癌、前列腺癌中異常表達或存在生化修飾，在腫瘤外緣具有強侵襲作用的癌細胞中表達則更為顯著[19]，其表達與腫瘤分期、淋巴結轉移以及預后密切相關[20]。實際上，關于ADGRE5在胰腺癌中的表達早前亦有報道。Boltze等[21]采用免疫組化法檢測50例胰腺癌組織、40例胰腺炎組織、36例正常胰腺組織中ADGRE5的表達，發現ADGRE5在胰腺炎中表達較強，在低分化胰腺癌中弱表達，而在正常胰腺和中、高分化胰腺癌組織中并不表達。Aust等[22]采用免疫組化法檢測18例胰腺癌組織和流式細胞術檢測胰腺癌細胞系PANC-1、BXPC3中ADGRE5的表達，發現兩種細胞系和14例胰腺癌組織中ADGRE5均陽性。本實驗發現，ADGRE5在胰腺癌中廣泛表達，陽性率高達95%(55/58)，本組樣本量較上述兩項研究稍多，初步解決了ADGRE5在胰腺癌組織中表達的爭議問題。機制方面，ADGRE5在腫瘤中的作用機制多樣，如通過其細胞外結構域與整合素a5b1和avb3相互作用促進血管內皮細胞遷移和生成[23]、對BCL-2超家族中抗凋亡和促凋亡成員的調節[24]等，本實驗中ADGRE5表達與TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移密切相關，是胰腺癌患者預后的危險因素之一，ADGRE5可能廣泛參與胰腺癌發生、發展等多個環節，其深入機制仍有待于進一步探究。

綜上所述，本實驗以胰腺癌作為研究對象，利用生物信息學分析系統性初篩、臨床樣本驗證，在mRNA和蛋白水平探討aGPCRs在胰腺癌中的表達模式及其生物學意義。實驗結果表明，ADGRE5、ADGRA2、ADGRC3、ADGRF1、ADGRF4、ADGRG6 mRNA在胰腺癌組織中高表達，且與患者預后相關，是胰腺癌潛在的預后生物學標志物。ADGRF4、ADGRE5在蛋白水平高表達且與胰腺癌臨床病理特征密切相關，是胰腺癌患者預后的危險因素，隨著對其結構和功能機制的深入研究，有望成為胰腺癌治療的重要靶點。