FABP4表達上調促進人子宮內膜癌細胞系HEC-1-A增殖和遷移

賀 晶，李 艷，王延峰，鮑 慧

(延安大學附屬醫院 1.婦科； 2.檢驗科； 3.腫瘤科，陜西 延安 716000)

子宮內膜癌(endometrial cancer)是常見的女性生殖系統腫瘤，發病率有逐年上升的趨勢，5年生存率不足30%。因此，研究子宮內膜癌的發病機制，對于提高治療效果具有重要意義[1-2]。脂肪酸結合蛋白4(fatty acid binding protein 4，FABP4)是脂肪代謝的重要調節因子，可參與調控基因表達和腫瘤相關的信號傳導，與腫瘤發生發展密切相關[3]。FABP4在乳腺癌和肺癌等多種腫瘤中表達上調，參與腫瘤細胞的增殖和分化等病理學過程[4-5]。然而，FABP4在子宮內膜癌中的表達及其作用尚不清楚。本研究擬分析FABP4在子宮內膜癌組織中的表達，以探討其與子宮內膜癌臨床病理特征的關系；通過干擾FABP4表達以探討FABP4對子宮內膜癌細胞系HEC-1-A增殖、遷移和侵襲的影響，以期為子宮內膜癌發病機制及治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：人子宮內膜癌細胞系HEC-1-A(中國科學院細胞庫)

1.1.2 試劑及試劑盒：si-FABP4和si-NC(廣州市銳博生物科技有限公司設計合成)；噻唑藍(MTT)試劑盒和ECL發光液(ThermoFisher Scientific公司)；胎牛血清和RPMI 1640培養基(Gbico公司)；FABP4和β-actin引物序列(上海生工生物工程有限公司設計合成)；HiperFect Transfection Reagent(Qiagen公司)；兔抗人FABP4、MMP-2和MMP-9單克隆抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 子宮內膜癌組織的獲取：選取2017年3月至2021年3月在延安大學附屬醫院進行治療的71例子宮內膜癌患者為研究對象，所有患者均經病理學診斷為子宮內膜癌，且在術前未經任何放射治療與化學治療，手術過程中取癌組織及癌旁組織，并于-80 ℃冰箱保存，該研究得到本院倫理委員會的批準(批號：201702-21)以及家屬的知情同意。

1.2.2 細胞的分組及轉染：將EC-1-A細胞分為對照組、FABP4陰性對照(si-NC)組和干擾FABP4(si-FABP4)組。HEC-1-A細胞匯合至70%左右時，分別轉染干擾FABP4表達質粒(si-FABP4)及陰性對照質粒(si-NC)，對照組不做轉染處理，轉染4 h后更換新鮮RPMI 1640培養液培養24 h，進行后續實驗。

1.2.3 RT-qPCR檢測FABP4水平：用RT-qPCR檢測子宮內膜癌組織及各組細胞中FABP4 mRNA相對表達量，Trizol試劑提取總RNA，用反轉錄試劑盒合成cDNA后，進行RT-qPCR擴增。FABP4上游引物序列(5′-3′)：CGGAATTCATGTGTGATGCTTTTG TAGGTACC；下游引物序列(5′-3′)：ATAAGAATGC GGCCGCTTATGCTCTCTCATAAACTCTCGTG。β-actin上游引物序列(5′-3′)：CAAGGTCATCCATGACAA CTTTG；下游引物序列(5′-3′)：GTCCACCACCTGTT GCTGTAG。以β-actin為內參，采用2-△△Ct法計算FABP4 mRNA相對表達量。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖：用MTT法檢測轉染后HEC-1-A細胞增殖。將轉染后HEC-1-A培養48 h后，每孔加入10 μL的MTT液(濃度5 g/L)繼續培養4 h，再加入150 μL的DMSO溶液，振蕩溶解，在酶標儀490 nm處檢測吸光度(A)值。

1.2.5 細胞平板集落實驗檢測各組HEC-1-A細胞的集落形成能力：取轉染后對數增殖期的各組HEC-1-A細胞接種于6孔板中，每隔3 d觀察細胞形態，至肉眼可見單個集落形成時終止培養，多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色10 min，觀察并拍照，計算集落形成率。

1.2.6 Transwell小室法檢測細胞遷移與侵襲：遷移：取各組轉染HEC-1-A細胞，用無血清培養液將細胞制成細胞懸液，接種于Transwell上室中，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養液，繼續培養24 h，多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色15 min。隨機選擇5個視野于顯微鏡下觀察遷移細胞數。侵襲：無血清培養基稀釋融化的Matrigel，加60 μL于Transwell上室，待基質膠凝固，Transwell上室加入200 μL無血清稀釋的各組細胞懸液，其余步驟同上。隨機選擇5個視野于顯微鏡下觀察侵襲細胞數。

1.2.7 免疫印跡法(Western blot)檢測FABP4、MMP-2和MMP-9蛋白表達：提取各組細胞總蛋白并檢測蛋白濃度，每組取10 μg蛋白經SDS-PAGE后，經轉膜封閉后，分別加入抗FABP4、MMP-2、MMP-9或β-actin單克隆抗體，室溫孵育2 h，PBST洗滌再加二抗稀釋液孵育1 h，再加ECL發光液顯色，以β-actin為內參，分析條帶灰度值結果。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 FABP4在子宮內膜癌患者癌組織和癌旁組織的表達

子宮內膜癌組織中FABP4表達為(2.58±0.26)顯著高于癌旁(1.05±0.13)(P<0.05)。

2.2 FABP4表達與子宮內膜癌臨床病理特征的關系

根據子宮內膜癌組織中FABP4表達水平，將子宮內膜癌患者分為FABP4高表達(≥2.58)35例和FABP4低表達(<2.58)36例，分析發現FABP4表達與腫瘤TNM分期和淋巴結轉移有關(P<0.05)，而與患者年齡、腫瘤直徑、肌層浸潤和分化程度無關(表1)。

表1 FABP4 mRNA表達與子宮內膜癌臨床病理 特征的關系

2.3 各組細胞FABP4及蛋白的表達水平

與對照組和si-NC組相比，si-FABP4組HEC-1-A細胞FABP4及蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)(圖1)。

*P<0.005 compared with control group; #P<0.005 compared with si-NC group圖1 各組細胞FABP4蛋白表達Fig 1 FABP4 protein expression in each group of cells

2.4 Si-FABP4轉染對HEC-1-A細胞增殖的影響

與對照組和si-NC組相比，si-FABP4組HEC-1-A細胞吸光度(A)值顯著降低(P<0.05)(圖2)。

*P<0.005 compared with control group; #P<0.005 compared with si-NC group圖2 轉染si-FABP4后HEC-1-A細胞增殖Fig 2 Proliferation of HEC-1-A cells after transfec- tion of si-FABP4(x±s，n=6)

2.5 Si-FABP4轉染對HEC-1-A細胞集落形成能力的影響

與對照組和si-NC組相比，si-FABP4組HEC-1-A細胞集落形成率顯著降低(P<0.05)(圖3)。

*P<0.005 compared with control group; #P<0.005 compared with si-NC group圖3 各組HEC-1-A細胞集落形成Fig 3 Formation of HEC-1-A cell colonies in each

2.6 Si-FABP4轉染對HEC-1-A細胞遷移與侵襲能力的影響

與對照組和si-NC組相比，si-FABP4組HEC-1-A細胞遷移數與侵襲數顯著降低(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.005 compared with si-NC group圖4 各組HEC-1-A細胞遷移侵襲Fig 4 Migration and invasion of HEC-1-A cells in each

2.7 Si-FABP4轉染對HEC-1-A細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響

與對照組和si-NC組相比，si-FABP4組HEC-1-A細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達量顯著降低(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.005 compared with si-NC group圖5 各組HEC-1-A細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達Fig 5 Protein expression of MMP-2 and MMP-9 in HEC-1-A cells in each

3 討論

子宮內膜癌是三大常見婦科惡性腫瘤，由于早期癥狀不明顯，多數患者確診時已進展到晚期。該腫瘤惡性程度高、病死率高、預后差。腫瘤復發、侵襲和轉移是影響患者預后重要因素。因此，研究子宮內膜癌侵襲與轉移的機制，對于提高子宮內膜癌的療效及改善預后有重要意義[6-7]。

多項報道顯示，FABP4與乳腺癌及肝癌等腫瘤相關疾病有關[8-9]。有研究表明[10]，結腸癌患者腫瘤組織中FABP4表達水平升高，且是結腸癌發生發展的獨立風險因素。還有研究表明[11]，乳腺癌組織中FABP4表達水平顯著增加，且與乳腺癌轉移有關；敲低或過表達FABP4后，可抑制或促進乳腺癌細胞侵襲。本研究結果顯示，子宮內膜癌組織中FABP4表達水平顯著高于癌旁組織。提示，FABP4表達與子宮內膜癌發生有關。通過分析FABP4與子宮內膜癌臨床病理特征相關性，發現FABP4表達與腫瘤TNM分期和淋巴結轉移有關。提示，FABP4可能參與子宮內膜癌的發生發展。

FABP4在多種癌細胞中表達上調，可顯著促進腫瘤細胞的侵襲與遷移，而抑制FABP4表達，可顯著抑制細胞轉移能力[12]。本研究發現，干擾FABP4表達水平可顯著降低HEC-1-A細胞增殖、遷移和侵襲行為，與前人研究結果類似，提示，FABP4在子宮內膜癌遷移與侵襲過程中發揮重要作用。然而，其具體作用機制尚不清楚。研究表明，腫瘤細胞外基質的降解及基底膜破壞是腫瘤細胞發生侵襲和轉移的重要原因。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)可降解細胞外基質，其中MMP-2和MMP-9是重要的MMPs，在增強腫瘤細胞侵襲中發揮重要作用[13]。本研究干擾FABP4表達后，HEC-1-A細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達量顯著降低。提示，干擾FABP4表達可影響HEC-1-A細胞遷移侵襲相關蛋白表達。由此推測，子宮內膜癌中FABP4表達上調可促進子宮內膜癌細胞的侵襲及轉移。

綜上所述，FABP4在子宮內膜癌組織中高表達，且與腫瘤TNM分期和淋巴結轉移有關，干擾FABP4表達可抑制子宮內膜癌細胞增殖、遷移及侵襲，但其具體作用機制尚不完全清楚，仍需作進一步研究。