雷公藤多苷減輕干燥綜合征模型小鼠炎性反應(yīng)

劉珈言，梅 蓉，楊禮鳳，趙文彬，韓成龍，周 慧，李二龍

(四川大學(xué)華西醫(yī)院 皮膚性病科， 四川 成都 610041)

干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome,sicca syndrome，SS)是自身免疫性疾病，發(fā)病部位多見于淚腺、唾液腺，表現(xiàn)為口舌發(fā)干、干燥性結(jié)膜炎，嚴(yán)重時導(dǎo)致內(nèi)臟受損[1]。該病的發(fā)病率極高，發(fā)病機(jī)制也有待探索，其治療也無根治方法，目前以對癥治療為主，多采用糖皮質(zhì)激素、羥基氯喹、免疫抑制劑、生物制劑等藥物，但是治療效果并非盡如人意，甚至部分藥物會產(chǎn)生較明顯的副作用和異常反應(yīng)，目前，發(fā)掘療效好且異常反應(yīng)小的藥物是研究重點[2-3]。中醫(yī)講，SS主要伴有肝氣郁結(jié)、脾肺失調(diào)等。雷公藤多苷(Tripterygiumwilfordiiglycosides,TWPS)是具有免疫調(diào)節(jié)功能的中藥材，可用于滋陰生津，修復(fù)肝腎陰虛[4]。PI3K/Akt/eNOS信號通路與氧化應(yīng)激，炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)代謝紊亂密切相關(guān)[5]，因此，該信號通路可能是治療干燥綜合征的靶點。所以本文建立模型小鼠，經(jīng)實驗研究TWPS對SS型小鼠炎性反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性小鼠84只，體質(zhì)量(150±10)g[河南環(huán)宇康禾生物科技有限公司，許可證號：SCXK(豫)2020-0004]。于普通級環(huán)境下動物房飼養(yǎng)，鼠籠安靜整潔，室內(nèi)溫度保持在(15～25)℃，空氣流通干燥。

1.1.2 藥物與試劑：雷公藤多苷(TWPS)(純度>98%，經(jīng)過水-氯仿及硅膠柱色譜的初步提純，廣州分析測試中心科力技術(shù)開發(fā)公司)；硫酸羥氯喹(hydroxychloroquine sulfate，HCS)(上海源葉生物科技有限公司)；IL-6 ELISA試劑盒(北京潤澤康生物科技有限公司)； IL-17 ELISA試劑盒(北京奇松生物科技有限公司)；IgG ELISA試劑盒(上海群己生物科技有限公司)；兔源一抗(北京易科拜德科技有限公司)；羊抗兔二抗(廣州鑫邦生物科技有限公司)；Wortmanin抑制劑(江蘇碧云天生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：將小鼠按照隨機(jī)分?jǐn)?shù)法分為對照組、干燥綜合征模型組、硫酸羥氯喹組(20 mg/kg灌胃)、雷公藤多苷低、中和高劑量組(10、20、30 mg/kg 灌胃)、TWPS+Wortmanin(PI3K/Akt/eNOS信號通路抑制劑)組，每組各12只。

1.2.2 唾液流率、飲水量的檢測：待最后1次給藥24 h后，測定每只小鼠1 d的唾液流率及飲水量。

1.2.3 全血黏度和血漿黏度的檢測：取血5 mL，其中3 mL用于測定血液流變學(xué)指標(biāo)。剩余血液靜置后離心15 min，取上清液(血清)儲于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 ELISA測定 IL-6、IL-17、IgG、eNOS：ELISA試劑盒測定血清IL-6、IL-17、IgG、eNOS，所有實驗操作均以說明書為準(zhǔn)。

1.2.5 Western blot檢測PI3K/Akt/eNOS通路蛋白：頜下腺組織提取總蛋白，電泳，轉(zhuǎn)移，截取蛋白條，封閉，一抗4℃孵育過夜，漂洗3次，二抗孵育，漂洗后顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠模型唾液流率、飲水量

模型組較對照組唾液流率下降，飲水量增加(P<0.05)；雷公藤多苷低、中、高劑量組較模型組唾液流率增加，飲水量下降(P<0.05)；雷公藤多苷+Wortmanin組較雷公藤多苷低、中、高劑量組唾液流率下降，飲水量增加(P<0.05)(表1)。

表1 雷公藤多苷對干燥綜合征小鼠唾液流率和 飲水量的影響

2.2 各組小鼠全血黏度和血漿黏度

模型組較對照組全血和血漿黏度增加(P<0.05)；雷公藤多苷低、中、高劑量組全血及血漿黏度較模型組降低(P<0.05)；雷公藤多苷+Wortmanin組全血及血漿黏度較雷公藤多苷低、中、高劑量組增加(P<0.05)(表2)。

表2 各組全血黏度和血漿黏度

2.3 各組小鼠血清IL-6、IL-17、IgG、eNOS水平

模型組血清IL-6、IL-17、IgG水平較對照組增加，eNOS水平較對照組下降(P<0.05)；雷公藤多苷低、中、高劑量組血清IL-6、IL-17、IgG水平較模型組下降，eNOS水平較模型組增加(P<0.05)；雷公藤多苷+Wortmanin組血清IL-6、IL-17、IgG水平較雷公藤多苷低、中、高劑量組增加，eNOS水平較雷公藤多苷低、中、高劑量組下降(P<0.05)(表3)。

表3 各組血清IL-6、IL-17、IgG、eNOS水平Table 3 Levels of IL-6, IL-17, IgG and eNOS in serum of each

2.4 PI3K/Akt/eNOS通路蛋白

模型組較對照組p-PI3K/PI3K、 p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS水平下降(P<0.05)；雷公藤多苷低、中、高劑量組較模型組p-PI3K/PI3K、 p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS水平增加(P<0.05)；雷公藤多苷+Wortmanin組較雷公藤多苷低、中、高劑量組p-PI3K/PI3K、 p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS水平下降(P<0.05)(圖1，表4)。

圖1 PI3K/Akt/eNOS通路蛋白Fig 1 Proteins of PI3K/Akt/eNOS pathway

表4 PI3K/Akt/eNOS通路蛋白Table 4 PI3K/Akt/eNOS pathway

3 討論

干燥綜合征(SS)是彌漫性結(jié)締組織病，累及淚腺、唾液腺等外分泌腺體[6-7]，伴有口腔及角膜干燥，嚴(yán)重時會導(dǎo)致內(nèi)臟受損[8]。SS的病因復(fù)雜，受環(huán)境、遺傳等內(nèi)外因干擾。研究發(fā)現(xiàn)，SS患者免疫細(xì)胞出現(xiàn)異常改變，炎性因子免疫增加，炎性細(xì)胞擴(kuò)增至影響到其他組織和器官，迸發(fā)炎性反應(yīng)，損傷腺體和器官[9]。雷公藤多苷(TWPS)是具有免疫調(diào)節(jié)功能的中藥材，可滋陰生津，修復(fù)肝腎陰虛[10]、緩解炎性反應(yīng)，改善機(jī)體免疫等。本實驗分析TWPS對SS模型小鼠炎性作用的影響并探索其作用機(jī)制。

本實驗建立的SS小鼠模型完成后，小鼠唾液流率下降，飲水量增加，血清IL-6、IL-17增加證明模型成功且病情進(jìn)一步發(fā)展[11]。中醫(yī)講，SS主要伴有肝氣郁結(jié)、脾肺失調(diào)等，所以治療應(yīng)該以養(yǎng)肝潤肺、培元理氣等為主[12]。研究表明，TWPS可作為干燥綜合征的治療藥物，療效明顯[13]，并且對多種內(nèi)臟器官的急性損傷有緩解作用，能夠調(diào)控體液免疫，抑制Th細(xì)胞活性，達(dá)到間接控制β淋巴細(xì)胞的作用，減弱抗體效價[14-15]。磷酸化激活PI3K/Akt/eNOS信號通路可以調(diào)控炎性反應(yīng)，使血液中一氧化碳水平升高，從而抑制炎性反應(yīng)。實驗證明，模型組小鼠的唾液流率、eNOS水平下降，而TWPS能夠使小鼠的唾液流率、eNOS水平增加，并且降低小鼠飲水量、全血黏度、血漿黏度、血清IL-6、IL-17、IgG水平，TWPS對SS小鼠的作用與劑量和反應(yīng)時間有關(guān)，在無毒性反應(yīng)劑量內(nèi)，TWPS劑量越高，持續(xù)時間越長，作用效果越好，為證實雷公藤多苷通過調(diào)控PI3K/Akt/eNOS信號通路改善SS鼠的癥狀，設(shè)置了TWPS+Wortmanin組，其中Wortmanin為PI3K/Akt/eNOS信號通路抑制劑，經(jīng)過實驗對比該組小鼠唾液流率、飲水量、全血黏度高切、全血黏度低切、血漿黏度、血清IL-6、IL-17、IgG、eNOS水平及PI3K/Akt/eNOS通路蛋白發(fā)現(xiàn)，指標(biāo)數(shù)據(jù)與模型組小鼠差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明在通路抑制劑的影響下，即使是高劑量TWPS對SS模型小鼠也無治療效果，這證明TWPS對PI3K/Akt/eNOS信號通路有一定的調(diào)節(jié)控制作用。

TWPS能夠改善SS小鼠血液黏度及口干等癥狀，這與磷酸化激活PI3K/Akt/eNOS信號通路密切相關(guān)，但是否有其他的機(jī)制還需要進(jìn)一步實驗探索。本研究局限性在于只通過動物模型探索TWPS對SS的療效，至于在人類機(jī)體中是否有同樣效果還需深入研究。