他莫昔芬抑制TGF-β/Smad通路減輕人皮膚成纖維細胞病理性增生

史春田，毛姝然，彭譯萱，肖志波

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院 整形外科， 黑龍江 哈爾濱 150086)

增生性瘢痕(hyperplastic scar，HS)是一種由異常組織修復過程引起的皮膚纖維化疾病[1]，是皮膚損傷后最常見的并發癥，其病因尚不清楚。成纖維細胞的過度增殖分化及細胞外基質沉積是瘢痕形成的典型病理特征。據報道，高達70%的患者在燒傷后出現HS, 40%～70%的患者術后出現HS[2]。

皮膚纖維化的發病率與性別顯著相關，總體比例(女性:男性)約為6∶1，在生育期間達到10∶1[3-4]。雖然皮膚纖維化在女性中更常見，但來自歐洲硬皮病試驗和研究(EUSTAR)組的數據顯示，男性皮膚纖維化表現出更嚴重的表型，且預后更差[3]。且證實Balb/C、C57BL/6和DBA/2雄性小鼠比雌性小鼠更容易發生明顯的纖維化[5]。盡管瘢痕形成過程中存在公認的性別偏倚，但其確切作用及相關分子基礎仍然知之甚少。特別是性激素在調節瘢痕形成中的作用尚未明確。有研究表明，雌激素誘導成纖維細胞功能障礙，并增加細胞外基質蛋白的產生，而其他一些研究報道，雌激素治療后膠原蛋白的產生減少[6-7]。因此，更詳細探討干擾性激素在真皮纖維化發病機制中的作用具有重要意義。鑒于他莫昔芬是一種雌激素受體調節劑，評估他莫昔芬對轉化生長因子-β1(TGF-β1)誘導的真皮成纖維細胞的病理性增生的影響，具有潛在臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

免疫細胞化學試劑盒，PV-9000(ZSGB-BIO公司)；TGF-β1(R&D公司)；他莫昔芬(Selleck公司)；反轉錄試劑PrimeScript RT Master Mix、Ex Taq(TaKaRa公司)；α-SMA抗體(Sigma-Aldrich公司)；MTS試劑盒(Promege公司)；Bradford Protein Assay試劑盒(Bio-Rad公司)；Trizol試劑、熒光標記二抗(Invitrogen公司)；Alexa Flour594、DAPI、Fibronectin和α-SMA抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人皮膚成纖維細胞的分離和培養:無菌條件下采集人皮膚成纖維細胞標本(來自于哈爾濱醫科大學附屬第二醫院)，浸于含5%鏈霉素的PBS中。用無菌剪刀剪至真皮層，將組織切成1 cm×1 cm×1 cm大小，均勻放入75 cm2培養皿中。加入含有10%胎牛血清和1%鏈霉素-青霉素的DMEM培養基中，直至組織牢固附著于皿底(4～6 h)，然后在37 ℃、5% CO2的空氣中培養。每3 d換一次培養基，細胞匯合達到90%時用0.25%胰蛋白酶使細胞傳代。3～7代細胞用于實驗。

所有患者已簽署知情同意書，本研究經哈爾濱醫科大學附屬第二醫院倫理委員會批準實施(倫理審查批準號：KY2021-320)。

1.2.2 成纖維細胞鑒定:Vimentin免疫細胞化學染色鑒定成纖維細胞(PV-9000法，ZSGB-BIO公司)。具體步驟如下：

即貼壁細胞4 ℃冰丙酮固定 5 min；3% H2O2阻斷液 10 min；加兔抗人波形蛋白單克隆抗體一抗，4 ℃孵育過夜；滴加試劑 1(Polymer Helper)，37 ℃恒溫箱孵育 20 min；滴加試劑 2 (poly peroxidase-anti rabbit IgG)，37 ℃恒溫箱孵育2 h；DAB顯色、蘇木精液復染，脫水、透明和中性樹膠封固。顯微鏡下觀察并拍照，細胞呈棕黃色顯色作為陽性表達。

1.2.3 細胞處理及分組:成纖維細胞分為3組，即：對照組、TGF-β1組和TGF-β1+他莫昔芬組。依此將成纖維細胞(2×105個/孔)置于6孔板中，加入新鮮DMEM培養基12 h。對照組細胞不予以藥物干預，TGF-β1組在對照組基礎上加入10 ng/μL的TGF-β1處理48 h，TGF-β1+他莫昔芬組先用他莫昔芬(10 μmol/L)預處理細胞24 h，后使用TGF-β1(10 ng/μL)處理48 h。

1.2.4 細胞遷移:通過傷口愈合實驗檢測細胞遷移能力，具體步驟如下：在6孔板中接種等量的細胞。當細胞匯合度達到90%時，用1 mL無菌微管尖端刮取細胞，用PBS溫和洗滌3次以清除細胞碎片，然后加入低血清的培養基。劃痕后立即用光學顯微鏡拍照。孵育24 h后再次拍攝。利用Image J軟件測量細胞遷移引起的刮傷面積變化，確定創面愈合能力。

1.2.5 定量實時聚合酶鏈反應(RT-qPCR):用Trizol reagent (Invitrogen公司)從細胞中提取總RNA，并用PrimeScript RT Master Mix進行反轉錄。PCR引物序列見表1。采用SYBR預混劑ExTaq Ⅱ及real-time PCR系統進行定量檢測。采用2-ΔΔCT法計算相對mRNA表達。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.6 免疫熒光實驗:經過藥物處理的細胞用4%多聚甲醛固定10 min， 0.5% Triton X-100室溫穿透10 min，5% BSA室溫封閉1 h。α-SMA抗體孵育過夜。次日使用山羊抗小鼠的二抗AlexaFluor 594 及DAPI在室溫下進行染色。在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 細胞活力檢測:MTS按照說明進行細胞活性分析，將MTS/非那靜乙硫酸鹽混合試劑共10 μL加入96孔板的每個孔中，37 ℃ CO2培養箱中孵育3 h。使用TECAN GENIOS酶標儀測定490 nm處的吸光度。

1.2.8 免疫印跡:將細胞在預冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗滌1次，并在含有蛋白酶抑制劑(Roche公司)的裂解緩沖液中收集裂解液，通過高速離心(4 ℃，14 000 g, 10 min)收集上清。用Bradford protein assay 試劑盒測定裂解物的蛋白濃度。從每個樣品中提取等量的蛋白質，SDS-PAGE分離，然后轉移到硝酸纖維素膜上。在5%牛奶封閉1 h，一抗孵育4 ℃過夜。次日用熒光標記二抗室溫下孵育1 h。抗體結合用增強的化學發光檢測系統進行可視化。使用Image J軟件計算蛋白相對表達。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 人成纖維細胞鑒定

免疫細胞化學結果顯示(圖1)，倒置相差顯微鏡下細胞 Vimentin 染色呈陽性符合人成纖維細胞特性。

A.×40；B.×100圖1 免疫細胞化學鑒定人成纖維細胞Fig 1 Immunocytochemical identification of human- fibroblasts

2.2 他莫昔芬抑制TGF-β1誘導的人皮膚成纖維細胞增殖

MTS結果顯示(圖2)，與對照組相比，TGF-β1可以誘導人皮膚成纖維細胞增殖。與TGF-β1組相比，10 μmol/L的他莫昔芬處理后，成纖維細胞增殖能力顯著降低(P<0.05)。

△P<0.05 compared with the control group,TGF-β1 induced proliferation of skin fibroblasts;*P<0.05 compared with TGF-β1 group, the proliferation ability of fibroblasts was significantly reduced after tamoxifen treatment圖2 MTS實驗檢測細胞在490 nm處的吸光度值Fig 2 Absorbance value of cells at 490 nm detected

2.3 他莫昔芬抑制TGF-β1誘導的皮膚成纖維細胞遷移

傷口愈合實驗結果顯示，與對照組相比，TGF-β1組皮膚成纖維細胞傷口愈合能力增強(P<0.05)；與TGF-β1組相比，他莫昔芬處理組傷口愈合能力被抑制，細胞遷移能力降低(P<0.05)(圖3)。

△P<0.05 compared with the control group, the wound healing ability of skin fibroblasts in TGF-β1 group was enhanced; *P<0.05 compared with TGF-β1 group, wound healing ability was inhibited and cell migration ability was decreased in the tamoxifen treatment group

2.4 他莫昔芬抑制TGF-β1誘導的皮膚成纖維細胞向肌成纖維細胞分化

免疫熒光染色結果表明，TGF-β1顯著促進α-SMA的表達，而他莫昔芬處理后細胞α-SMA表達降低。說明他莫昔芬抑制了TGF-β1誘導的皮膚成纖維細胞向肌成纖維細胞分化(圖4)。

圖4 免疫熒光法檢測細胞分化Fig 4 Cell differentiation was detected by immunofluorescence assay (×400)

2.5 他莫昔芬抑制TGF-β1誘導的人皮膚纖維化相關基因mRNA的表達

與TGF-β1組相比，他莫昔芬能夠顯著抑制COL1、COL3、肌成纖維細胞標志物α-SMA的mRNA水平(P<0.05)(圖5)。

*P<0.01 compared with the control group, TGF-β1 promoted the mRNA expression levels of COL1, COL3 and α-SMA; #P<0.05 compared with the TGF-β1 group, tamoxifen could significantly inhibit the mRNA expression levels of COL1, COL3 and α-SMA

2.6 他莫昔芬抑制TGF-β1誘導的人皮膚纖維化相關蛋白的表達

Western blot檢測皮膚纖維化相關蛋白fibronectin和α-SMA的表達。與 RT-qPCR結果一致，TGF-β1能夠促進fibronectin和α-SMA蛋白水平，而他莫昔芬能夠顯著抑制fibronectin和α-SMA蛋白水平(P<0.05)(圖6)。

*P<0.05 compared with the control group, TGF-β1 could promote the levels of fibronectin and α-SMA protein; #P<0.05 compared with TGF-β1 group, tamoxifen could inhibit fibronectin and α-SMA protein levels

2.7 他莫昔芬抑制TGF-β1/Smad信號通路參與瘢痕形成

Western blot結果顯示，與對照組相比，TGF-β1組中的TGF-β1、Smad和p-Smad蛋白表達均顯著增加(P<0.05)；與TGF-β1組相比，他莫昔芬處理組TGF-β1、Smad和p-Smad蛋白表達均顯著抑制(P<0.05)(圖7)。

*P<0.05 compared with the control group, the protein expressions of TGF-β1, Smad and P-Smad were increased in TGF-β1 group; #P<0.05 compared with TGF-β1 group, the protein expressions of TGF-β1, Smad and p-smad were significantly inhibited in tamoxifen treatment group

3 討論

HS不僅影響皮膚美觀，而且妨礙正常肌肉功能，給人們造成許多心理和生理困擾[8]。巨大經濟和社會負擔提示需對HS形成機制和預防措施進行研究。

激活的肌成纖維細胞是組織纖維化的關鍵效應細胞[9]。活化成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，產生細胞外基質和蛋白酶，導致炎癥條件下正常組織結構的異常破壞，是瘢痕形成的主要病理學過程。傷口過度修復過程中釋放的TGF-β是成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞的主要驅動因素[10]。因此，識別并阻止TGF-β誘導的肌成纖維細胞形成的因子可能為治療異常組織重塑提供有新思路。

他莫昔芬是一種合成的選擇性雌激素受體(ER)調節劑。最近，由于性激素在瘢痕形成過程中的作用逐漸被發現，關于性激素在皮膚瘢痕發展過程中作用的數據在不同的研究組織中是復雜和矛盾的。他莫昔芬因其抗纖維化特性引起了人們的關注[11-12]，其機制尚不清楚。在本研究中，發現了他莫昔芬抑制TGF-β在人皮膚成纖維細胞中的潛在作用。他莫昔芬能有效抑制TGF-β1驅動的肌成纖維細胞標記蛋白的表達和成纖維細胞的增殖活化以及細胞外基質沉積，可能對病理條件下激活的肌成纖維細胞具有治療潛力。

許多研究表明他莫昔芬具有抗纖維化特性。他莫昔芬已被證明能抑制腎纖維化[11,13]，腹膜纖維化[14]、肥厚性瘢痕[15]以及硅誘導肺纖維化[12]。在這些研究中，他莫昔芬的作用與受影響組織中TGF-β和其他生長因子的表達下調有關[12,16]。雖然在實驗中沒有探索其他自分泌生長因子表達的變化，但實驗證明，他莫昔芬可以阻止TGF-β誘導的成纖維細胞分化。本實驗通過分析磷酸化的Smad2和Smad3表達水平，發現他莫昔芬能夠抑制Smad通路的激活。提示除抑制TGF-β1的表達外，他莫昔芬還可以阻斷TGF-β/Smad信號通路的活化，從而發揮抑制成纖維細胞過度活化的作用。

此外，肌成纖維細胞除了是組織纖維化的效應細胞外，還與癌發生高度相關[17]。在這種情況下，它們被稱為癌癥相關的成纖維細胞，并已被證明釋放可溶性介質和細胞外基質，為腫瘤生長和轉移營造有利的微環境[18-19]。肌成纖維細胞的這一功能是當前研究的重點。他莫昔芬在臨床上用于治療乳腺癌患者[20]。如果他莫昔芬抑制與癌癥相關的成纖維細胞的激活，那么還可能具有抗癌益處。因此，莫西芬對其他腫瘤中激活成纖維細胞的潛在作用也值得探索。