淫羊藿苷改善重癥急性胰腺炎模型大鼠肺損傷

谷文浩，郭飛霞，徐宇鵬，陸馨雨，胡青青

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310000； 2.溫州市鹿城區(qū)人民醫(yī)院 內(nèi)科，浙江 溫州 325000； 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 3.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室； 4.第一臨床醫(yī)學(xué)院； 5.兒科，浙江 溫州 325000)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)最主要的致死機(jī)制是系統(tǒng)性炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS),其是導(dǎo)致包括肺損傷，成人呼吸窘迫綜合征在內(nèi)的多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的共同病理生理基礎(chǔ)[1]。急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的發(fā)生率高居MODS所有累及臟器第一位，是SAP早期死亡的首要原因[2]。

中國中醫(yī)藥經(jīng)過幾千年的傳承和發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了大量藥材含有抑制機(jī)體炎性反應(yīng)的有效成分。國內(nèi)外學(xué)者從淫羊藿(epimedium)中提取其主要藥理成分-淫羊藿苷(icariin, ICA)，發(fā)現(xiàn)其能有效保護(hù)腦缺血/再灌注損傷,抑制脊髓損傷氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)[3-4]。但其對SAP所致SIRS和肺損傷的保護(hù)作用研究還屬空白。本文旨在探討淫羊藿苷(ICA)保護(hù)SAP大鼠肺損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級8周齡雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量210～220 g[由溫州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物合格證號為SCXK(浙)2020-0001]。大鼠飼養(yǎng)在相對濕度為50%±1%、溫度為(24±1)℃、每天黑暗及光照時間各12 h環(huán)境下。大鼠自由進(jìn)食，自由飲水，2只1籠飼養(yǎng)。所有動物研究嚴(yán)格按照溫州醫(yī)科大學(xué)動物保健機(jī)構(gòu)指南進(jìn)行。

1.1.2 試劑及試劑盒：C-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p-JNK、NF-κB、p-NF-κB抗體(Cell Signaling Technology公司)；IL-6、IL-1β和TNF-α抗體(Bioworld公司)；淫羊藿苷(ICA,北京源葉生物科技有限公司提取，純度≥97%)；HE染色試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)；牛黃膽酸鈉(Sigma-Aldrich公司)；IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA測定試劑盒(上海聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、模型組(SAP組，將5%牛黃膽酸鈉按0.1 mL/kg的劑量逆行泵入膽總管；牛黃膽酸鈉可誘導(dǎo)胰腺內(nèi)胰蛋白酶激活，致使胰腺充血壞死，其SAP病理改變更接近臨床[5])和實(shí)驗(yàn)組(ICA組，于造模前2 h灌胃淫羊藿苷 80 mg/kg進(jìn)行干預(yù))。每組6只，24 h后觀察各組大鼠狀態(tài)，均無死亡。收集胰腺、肺臟組織以及下腔靜脈血清用于后續(xù)檢測。

1.2.2 HE染色檢測肺臟和胰腺病理損傷程度:將胰腺組織和肺組織用4%多聚甲醛固定，乙醇濃度梯度脫水后石蠟包埋。蠟塊用切片機(jī)制備5 μm厚度的組織切片，經(jīng)脫蠟后按說明書操作進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察肺臟和胰腺病理損傷程度(采用改良Schmidt法[6]對胰腺損傷程度進(jìn)行評分，采用Gustavo Matute-Bello法[7]對肺損傷程度進(jìn)行評分)。

1.2.3 ELISA檢測血清中淀粉酶活性、IL-6、IL-1β和TNF-α含量:按照操作說明書測定大鼠血清中淀粉酶活性、IL-6、IL-1β和TNF-α含量。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)量:肺組織切片脫蠟，用3% H2O237 ℃處理10 min后用5%山羊血清37 ℃封閉30 min。用稀釋系數(shù)為1∶200的IL-6、IL-1β和TNF-α一抗4℃孵育過夜；洗滌后，用二抗對切片37 ℃孵育30 min；洗滌后，滴入DAB顯色光鏡下觀察陽性區(qū)域并用Image J軟件定量。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡檢測JNK/NF-κB信號通路蛋白表達(dá)：將肺組織勻漿于RIPA裂解液中并收集上清液。用BCA方法檢測總蛋白濃度后，用SDS-PAGE分離等量蛋白質(zhì)(30 μg)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜1 h,然后在4 ℃下與一抗p-JNK(1∶1 000)、JNK(1∶1 000)、p-NF-κB(1∶1 000)以及NF-κB(1∶1 000)孵育過夜。所有的膜均用Tris-緩沖液清洗3次并與二抗在室溫下孵育1 h。最后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液將條帶可視化并用Image J軟件定量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷(ICA)顯著減輕SAP大鼠胰腺和肺組織病理損傷

SAP組胰腺腺泡細(xì)胞間質(zhì)水腫、出血和壞死并伴有大量炎性浸潤；與SAP組相比，ICA組病理改變顯著減輕(圖1A)；胰腺病理評分明顯降低(P<0.01)(圖1B)。SAP組表現(xiàn)為肺泡間質(zhì)厚度增加，肺泡塌陷，炎性細(xì)胞浸潤；ICA組肺結(jié)構(gòu)有明顯改善(圖1A)。與sham組相比，SAP組肺損傷評分明顯上升(P<0.01)，而ICA組肺損傷評分明顯低于SAP組(P<0.01)(圖1C)。

*P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with SAP group (scale bar=200 μm)圖1 淫羊藿苷顯著減輕SAP模型大鼠胰腺和肺組織病理損傷Fig 1 Icariin significantly attenuated pathological injury of pancreas and lung tissue in SAP rat models

2.2 淫羊藿苷(ICA)減輕SAP大鼠血清淀粉酶活性和炎性因子含量

SAP組大鼠血清淀粉酶活性、IL-6、 IL-1β和TNF-α含量均顯著高于sham組(P<0.01)；ICA組大鼠血清淀粉酶活性、IL-6、 IL-1β和TNF-α含量均顯著低于SAP組(P<0.01)(表1)。

表1 淫羊藿苷減輕SAP模型大鼠血清淀粉酶活性和炎性因子含量Table 1 Icariin attenuated serum amylase activity and inflammatory factor contents in SAP rats

2.3 淫羊藿苷(ICA)減輕SAP大鼠肺組織中炎性因子含量

SAP組肺組織中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)量明顯高于sham組(P<0.01)；ICA組肺組織中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)量均明顯低于SAP組(P<0.01)(圖2)。

IOD:integrated optical density; *P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with SAP group (scale bar=200 μm)圖2 淫羊藿苷減輕SAP模型大鼠肺組織中炎性因子含量Fig 2 Icariin attenuated the contents of inflammatory factors in lung tissue of SAP rat

2.4 淫羊藿苷(ICA)顯著降低SAP大鼠肺組織中磷酸化JNK和磷酸化NF-κB水平

SAP組肺組織中磷酸化JNK和磷酸化NF-κB水平較sham組明顯升高(P<0.01)；ICA組磷酸化JNK和磷酸化NF-κB水平較SAP組明顯降低(P<0.01)(圖3)。

*P<0.01 compared with sham group； #P<0.01 compared with SAP group圖3 淫羊藿苷顯著降低SAP模型大鼠肺組織中磷酸化JNK和磷酸化NF-κB水平Fig 3 Icariin significantly decreased the levels of p-JNK and p-NF-κB in lung tissue of SAP rat

3 討論

目前國內(nèi)外所使用的針對負(fù)調(diào)控SIRS和保護(hù)SAP肺損傷的臨床抗炎藥物療效均不顯著。中國中醫(yī)藥中大量藥材含有抑制機(jī)體炎性反應(yīng)的有效成分,為探尋SAP治療新方法提供了全新思路。

SAP發(fā)生時，胰腺消化自身組織釋放大量蛋白水解酶和血管活性物質(zhì)，首先激活機(jī)體單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，釋放大量TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而使多形核粒細(xì)胞(polymorphonuclear granulocyte, PMN)活化。大量過度激活的PMN釋放諸如氧自由基，脂質(zhì)代謝產(chǎn)物等破壞性炎性介質(zhì)，從而形成級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)入惡性循環(huán)狀態(tài)[8]。肺臟是SIRS過度激活的主要受累臟器，是高濃度細(xì)胞因子，活化的中性粒細(xì)胞攻擊的主要靶器官。而肺內(nèi)細(xì)胞對這些因子和細(xì)胞的反應(yīng)也是導(dǎo)致肺損傷的關(guān)鍵因素[9]。SAP一旦發(fā)生相關(guān)肺損傷，如無有效干預(yù)手段或醫(yī)療干預(yù)不當(dāng)，極易致死。

本研究證實(shí)淫羊藿苷對SAP模型大鼠SIRS具有明顯的抑制作用,能降低其胰腺病理評分并顯著減少胰腺淀粉酶釋放。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷抑制肺損傷病變過程中產(chǎn)生的IL-6、TNF-α、IL-1β等炎性因子的表達(dá)，減輕SAP引發(fā)的肺損傷。這是淫羊藿苷通過負(fù)調(diào)控SIRS,減輕SAP肺損傷的表現(xiàn)。

JNK是絲裂原活化蛋白激酶的主要成員之一，它在細(xì)胞周期、增殖、凋亡和細(xì)胞應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用[10-11]。JNK在真核細(xì)胞的胞質(zhì)中廣泛分布，一旦細(xì)胞受到細(xì)胞因子、應(yīng)激、表皮生長因子等刺激因素?fù)p傷時，迅速發(fā)生磷酸化并轉(zhuǎn)移入核，作用于下游的NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，從而在炎性應(yīng)激反應(yīng)中起到重要作用[12]。已有研究表明，在模型大鼠SAP早期，肺組織中JNK信號通路即被激活，從而上調(diào)NF-κB的磷酸化表達(dá)，而活化的NF-κB又可進(jìn)一步上調(diào)肺組織中TNF-α、ICAM-1、IL-1β表達(dá)，二次加重肺組織炎性反應(yīng)和損傷[13]。本研究發(fā)現(xiàn)SAP模型大鼠肺組織中磷酸化JNK和磷酸化NF-κB的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而淫羊藿苷能顯著抑制JNK和NF-κB的磷酸化。

綜上所述，SAP模型大鼠中應(yīng)用淫羊藿苷干預(yù)，可能通過抑制JNK/NF-κB信號通路介導(dǎo)的全身急性炎性反應(yīng)，有效減輕SAP模型大鼠胰腺損傷和肺損傷，為深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。