過表達(dá)miR-217調(diào)控EZH2促進(jìn)骨質(zhì)疏松模型小鼠BM-MSCs成骨分化

阮 鋒，李賀偉*，龔艷琳，劉佳麗，劉 平

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院 骨科，湖北 武漢 430077；2.武漢市第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430030)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是一種骨代謝紊亂的疾病，在絕經(jīng)女性中高發(fā)，其可增加骨折風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)絕經(jīng)女性健康構(gòu)成不利影響[1]。另外，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)是成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，其成骨分化能力可影響骨形成，在OP發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[2-3]。因此，尋找影響B(tài)M-MSCs成骨分化的有關(guān)機(jī)制，對(duì)治療OP有積極意義。微小RNA-217(microRNA-217，miR-217)是微小RNA(microRNA, miRNA)的一員，其與血管生成、腎臟疾病、腫瘤、OP發(fā)生發(fā)展等相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-217在股骨頭壞死患者的BM-MSCs中表達(dá)下調(diào)，BM-MSCs成骨分化能力降低，過表達(dá)miR-217可通過靶向調(diào)節(jié) Dickkopf相關(guān)蛋白1表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)BM-MSCs向成骨分化[5]；且miR-217可通過靶向調(diào)節(jié)蛋白激酶B γ表達(dá)進(jìn)而影響成骨分化[5]。以上研究表明，miR-217可能通過靶向調(diào)控有關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而影響成骨分化，為治療OP提供思路。此外，抑制果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)表達(dá)可促進(jìn)祖細(xì)胞成骨分化[6]，其可能為改善骨量提供新策略。且有關(guān)報(bào)道顯示，miR-217可通過靶向調(diào)控EZH2表達(dá)進(jìn)而影響胃癌發(fā)展[7]。因此，推測(cè)miR-217可通過調(diào)控EZH2表達(dá)進(jìn)而影響OP小鼠BM-MSCs成骨分化。因此，本文通過構(gòu)建OP小鼠模型，分離培養(yǎng)BM-MSCs，觀察miR-217、EZH2在OP小鼠BM-MSCs中的表達(dá)情況，初步探究二者對(duì)BM-MSCs的作用機(jī)制，以期為臨床診治OP提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)24只C57BL/6雌性小鼠，9周齡，體質(zhì)量(20±2)g]廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK(粵)2021-0057。實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》。

1.1.2 試劑：α-MEM培養(yǎng)基(BC-M-042-500mL)(南京森貝伽生物科技有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、β-甘油磷酸鈉、地塞米松和抗壞血酸(北京索萊寶科技有限公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(K1622)(上海康朗生物科技有限公司)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RIPA裂解液(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)；茜素紅S(alizarin red S，ARS)染色試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；SYBR Green Real-time PCR Master Mix(QPK-201)(TOYOBO公司)；一抗兔源Runt相關(guān)基因2(Runt-related transcription gene 2, Runx2)抗體、骨鈣素(osteocalcin，OCN)抗體、Ⅰ型膠原(collagen typeⅠ, collagenⅠ)抗體、GAPDH抗體、EZH2抗體及辣根過氧化物酶綴合的二抗(Abcam公司)；miR-217模擬物陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-217模擬物(miR-217 mimics)、空載體(pcDNA3.1)、EZH2過表達(dá)載體(pcDNA3.1-EZH2)及miR-217、U6、OCN、Runx2、collagenⅠ、EZH2、GAPDH引物、野生型EZH2(wild-type EZH2, WT-EZH2)載體、突變型EZH2(mutant EZH2, MUT-EZH2)載體(上海生工生物工程有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，參考文獻(xiàn)[8]方法構(gòu)建OP模型。經(jīng)腹腔注射給予小鼠戊巴比妥鈉(80 mg/kg，1.5%)麻醉，無菌環(huán)境下俯臥固定，備皮，行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，設(shè)置為OP組，其余小鼠僅切除雙側(cè)卵巢位置處的脂肪組織并設(shè)置為sham組，每組均為12只小鼠，術(shù)后所有小鼠均繼續(xù)飼養(yǎng)8周。sham組、OP組小鼠在處死前，均進(jìn)行micro-CT股骨掃描以確定OP造模成功。麻醉后處死各組6只小鼠，分離雙側(cè)股骨，剔除多余組織后，研碎，用于miR-217及EZH2 mRNA檢測(cè)。

1.2.2 BM-MSCs的分離及培養(yǎng)：按參考文獻(xiàn)[9]提取小鼠BM-MSCs，接種于α-MEM培養(yǎng)液(含10%FBS)中，每3 d更換1次培養(yǎng)液，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。至細(xì)胞增殖至80%左右，胰蛋白酶消化傳至3～4代，用于miR-217及EZH2 mRNA檢測(cè)及成骨誘導(dǎo)分化。

1.2.3 BM-MSCs的成骨誘導(dǎo)分化及細(xì)胞的分組及處理：將從OP小鼠分離且培養(yǎng)3～4代的BM-MSCs(2×106細(xì)胞)接種于6孔板，待BM-MSCs匯合至80%左右，將細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-NC組、miR-217 mimics組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1組和miR-217 mimics+pcDNA 3.1-EZH2組。用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒分別對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染12 h，其中miR-NC 和miR-217 mimics均為20 pmol/L，pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-EZH2質(zhì)粒4 μg。之后加成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液(含0.2%抗壞血酸、0.01%地塞米松、1% β-甘油磷酸鈉、1%青霉素-鏈霉素及10% FBS的α-MEM培養(yǎng)基)，每3 d換1次成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d，顯微鏡觀察BM-MSCs細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)骨組織/BM-MSCs中miR-217、EZH2、OCN、Runx2、collagenⅠ mRNA表達(dá)水平：以Trizol Reagent提取OP組、sham組小鼠骨組織/BM-MSCs(僅用于檢測(cè)miR-217、EZH2 mRNA表達(dá))及轉(zhuǎn)染后各組BM-MSCs總RNA，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄，收集cDNA，使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix、RT-qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，收集檢測(cè)指標(biāo)循環(huán)閾值(CT值)。擴(kuò)增參數(shù)：97.6 ℃ 8 min；95.2 ℃ 20 s，64.6 ℃ 20 s，62.5 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。miR-217以U6為內(nèi)參，EZH2、OCN、Runx2、collagen Ⅰ以Gapdh為內(nèi)參，引物序列見表1。miR-217、Ezh2、Ocn、Runx2、collagen Ⅰ 相對(duì)表達(dá)量以2-△△Ct法計(jì)算。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 ALP活性的檢測(cè)：細(xì)胞按ALP檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定各組BM-MSCs在波長(zhǎng)520 nm處的吸光度值，計(jì)算各組細(xì)胞ALP活性。

1.2.6 ARS染色檢測(cè)：將細(xì)胞用PBS清洗后，4%多聚甲醛固定10 min，清洗后，加入茜素紅染色液染色20 min，再次清洗后，顯微鏡下觀察各組細(xì)胞染色情況。

1.2.7 Western blot檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因及EZH2蛋白表達(dá)：低溫條件下用RIPA裂解液裂解各組誘導(dǎo)分化后細(xì)胞，BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。取50 μg樣品，經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、 封閉后，加入一抗Runx2、OCN、collagenⅠ、EZH2及GAPDH，4 ℃孵育過夜，清洗后，加二抗，室溫孵育2 h后，清洗3次。使用凝膠成像系統(tǒng)和Image Pro Plus軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證靶向關(guān)系：收集從OP小鼠分離的BM-MSCs，接種于24孔板(密度：2×104個(gè)/孔)，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，然后將構(gòu)建的野生型(WT-EZH2)和突變型(MUT-EZH2)載體與miR-NC或miR-217 mimics共轉(zhuǎn)染上述BM-MSCs 48 h，分為WT-EZH2+miR-NC組、(WT-EZH2+miR-217 mimics)組、(MUT-EZH2+miR-217 mimics)組和(MUT-EZH2+miR-NC)組。分別收集各組細(xì)胞并裂解20 min，離心后檢測(cè)各組上清液中熒光素酶活性，并以海腎熒光素酶活性為參照，計(jì)算熒光素酶相對(duì)活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠骨組織和BM-MSCs中miR-217及EZH2 mRNA表達(dá)水平

與sham組相比，OP組小鼠骨組織及BM-MSCs中miR-217表達(dá)水平降低(P<0.05)，EZH2 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with sham group圖1 各組小鼠骨組織及BM-MSCs中miR-217、EZH2 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 轉(zhuǎn)染后各組BM-MSCs中miR-217及EZH2表達(dá)情況

與對(duì)照組和miR-NC組相比，miR-217 mimics組BM-MSCs中miR-217表達(dá)水平升高(P<0.05)，EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與miR-217 mimics組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1組相比，miR-217 mimics+pcDNA 3.1-EZH2組BM-MSCs中EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖2～3)。

圖2 各組BM-MSCs中EZH2蛋白表達(dá)Fig 2 EZH2 protein expression in BM-MSCs of each group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with miR-NC group; △P<0.05 compared with miR-217 mimics group; ▲P<0.05 compared with miR-217 mimics+pcDNA 3.1 group圖3 轉(zhuǎn)染后各組BM-MSCs中miR-217及EZH2表達(dá)情況Fig 3 Expression of miR-217 and EZH2 in BM-MSCs of each group after n=6)

2.3 各組BM-MSCs ALP活性比較

與對(duì)照組和miR-NC組相比，miR-217 mimics組BM-MSCs ALP活性升高(P<0.05)；與miR-217 mimics組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1組相比，miR-217 mimics+pcDNA 3.1-EZH2組BM-MSCs ALP活性降低(P<0.05)(表2)。

表2 各組BM-MSCs ALP活性比較

2.4 各組BM-MSCs ARS染色情況

ARS染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組和miR-NC組相比，miR-217 mimics組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1-EZH2組BM-MSCs細(xì)胞染色程度較深；與miR-217 mimics組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1組相比，miR-217 mimics+pcDNA 3.1-EZH2組BM-MSCs細(xì)胞染色程度較淺；對(duì)照組和miR-NC組、miR-217 mimics組和miR-217 mimics+pcDNA 3.1組BM-MSCs細(xì)胞染色程度無明顯差異(圖4)。

圖4 各組BM-MSCs的茜素紅S(ARS)染色結(jié)果Fig 4 Alizarin reds(ARS) staining results of BM-MSCs in each group (×100)

2.5 各組BM-MSCs中成骨分化相關(guān)基因OCN、Runx2、collagenⅠ mRNA表達(dá)水平比較

與對(duì)照組和miR-NC組相比，miR-217 mimics組BM-MSCs中OCN、Runx2、collagenⅠ mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；與miR-217 mimics組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1組相比，miR-217 mimics+pcDNA 3.1-EZH2組BM-MSCs中OCN、Runx2、collagenⅠ mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with miR-NC group; △P<0.05 compared with miR-217 mimics group; ▲P<0.05 compared with miR-217 mimics+pcDNA 3.1 group圖5 各組BM-MSCs中OCN、Runx2、collagenⅠ mRNA表達(dá)水平比較Fig 5 Comparison of OCN, Runx2 and collagenⅠ mRNA expression levels in BM-MSCs of each

2.6 各組BM-MSCs中成骨分化相關(guān)蛋白OCN、Runx2、collagenⅠ表達(dá)水平比較

與對(duì)照組和miR-NC組相比，miR-217 mimics組BM-MSCs中OCN、Runx2、collagenⅠ蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與miR-217 mimics組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1組相比，miR-217 mimics+pcDNA 3.1-EZH2組BM-MSCs中OCN、Runx2、collagenⅠ蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)(圖6～7)。

圖6 各組BM-MSCs中OCN、Runx2、collagenⅠ 蛋白表達(dá)Fig 6 Expression of OCN, Runx2 and collagenⅠ proteins in BM-MSCs of each group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with miR-NC group; △P<0.05 compared with miR-217 mimics group; ▲P<0.05 compared with miR-217 mimics+pcDNA 3.1 group圖7 各組BM-MSCs中OCN、Runx2、collagenⅠ蛋白 表達(dá)水平比較Fig 7 Comparison of OCN, Runx2 and collagenⅠ protein expression levels in BM-MSCs of each

2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證miR-217與EZH2靶向關(guān)系

經(jīng)starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示，miR-217與EZH2 mRNA 3′UTR區(qū)有結(jié)合位點(diǎn)，見圖8。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，與WT-EZH2+miR-NC組比較，WT-EZH2+miR-217 mimics組熒光素酶相對(duì)活性降低(P<0.05)；MUT-EZH2+miR-NC組與MUT-EZH2+miR-217 mimics組熒光素酶相對(duì)活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

圖8 miR-217與EZH2 mRNA 3′UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn) 預(yù)測(cè)結(jié)果Fig 8 Prediction results of binding sites between miR-217 and EZH2 mRNA 3′UTR region

表3 各組雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果

3 討論

微小RNA是一類存在于骨組織、細(xì)胞中的非編碼RNA分子，其可調(diào)控BM-MSCs向成骨細(xì)胞分化[10]。miR-217在人脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, hADSCs)向成骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)水平升高，其可能在hADSCs成骨分化中起重要調(diào)控作用[11]；另外，miR-217可通過促進(jìn)成骨相關(guān)基因表達(dá)， 進(jìn)而在hADSCs向成骨細(xì)胞分化過程中起促進(jìn)作用[12]。提示miR-217可能參與OP發(fā)生發(fā)展，過表達(dá)miR-217可能改善OP。另外，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了過表達(dá)miR-217對(duì)OP小鼠BM-MSCs向成骨細(xì)胞分化的作用，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-217后，BM-MSCs中miR-217表達(dá)水平升高，ARS染色加深，ALP活性升高，表明過表達(dá)miR-217可促進(jìn)OP小鼠BM-MSCs成骨分化。OCN、Runx2、collagen Ⅰ與成骨分化關(guān)系密切，其可作為評(píng)估成骨分化能力的標(biāo)志物[13]。提示過表達(dá)miR-217通過促進(jìn)成骨分化相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)BM-MSCs成骨分化。

EZH2可參與細(xì)胞增殖，影響氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)機(jī)體發(fā)育，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，影響骨代謝平衡，與骨代謝疾病關(guān)系密切[14]。在炎性反應(yīng)條件下，人牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)中EZH2表達(dá)上調(diào)，且EZH2過表達(dá)可抑制OCN等成骨標(biāo)志物的表達(dá)，進(jìn)而抑制PDLSCs成骨分化，可能是治療牙周炎的潛在靶點(diǎn)[15]。提示EZH2可能是OP的治療靶點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-217后，BM-MSCs中EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)水平降低，且過表達(dá)EZH2可使BM-MSCs中miR-217表達(dá)水平略有降低，OCN、Runx2、collagenⅠ mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低，ARS染色程度、ALP活性降低，提示miR-217可能通過調(diào)節(jié)EZH2表達(dá)進(jìn)而影響OCN、Runx2、collagenⅠ等成骨分化相關(guān)基因表達(dá)，從而在BM-MSCs向成骨細(xì)胞分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

本研究利用starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ezh2的3’UTR序列中包含了miR-217的靶序列，表明miR-217可能與Ezh2存在調(diào)控關(guān)系。此外，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，miR-217可明顯抑制野生型EZH2熒光素酶活性，而對(duì)突變型EZH2熒光素酶活性無明顯影響，表明Ezh2是miR-217的直接靶點(diǎn)，且ALP、ARS染色實(shí)驗(yàn)、RT-qPCR、Western blot實(shí)驗(yàn)也表明了過表達(dá)EZH2可部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-217對(duì)OP小鼠BM-MSCs成骨分化的促進(jìn)作用，進(jìn)一步證實(shí)了在OP小鼠BM-MSCs中miR-217可負(fù)靶向調(diào)控EZH2表達(dá)。

綜上，過表達(dá)miR-217可通過靶向抑制EZH2表達(dá)，從而促進(jìn)OP小鼠BM-MSCs成骨分化。miR-217、EZH2有望成為診治OP的分子靶點(diǎn)，為防治OP提供新方案。但miR-217、EZH2對(duì)OP小鼠BM-MSCs成骨分化的影響機(jī)制尚不夠深入，后期可考慮結(jié)合臨床實(shí)驗(yàn)加以探究。