BRD4抑制劑JQ1對宮頸癌HeLa細胞增殖、凋亡和侵襲作用的研究*

鄭建清 黃碧芬 肖麗華 吳 敏

1 福建醫科大學附屬第二醫院放射治療科，福建省泉州市 362000； 2 泉州醫學高等專科學校附屬人民醫院婦產科

宮頸癌發病率位居全球婦女惡性腫瘤第二位[1]，而我國資料顯示，宮頸癌發病率位居婦科腫瘤第一位[2]。中晚期宮頸癌多以放化療為主，但仍有20%～30%患者治療后出現局部復發和轉移[3]。宮頸癌的發生發展可能是由于癌基因的激活和/或抑癌基因的失活等所致，后者導致細胞內基因的異常表達。與腫瘤相關的轉錄因子或轉錄調控子通過多種信號通路和蛋白家屬參與癌基因的激活和/或抑癌基因的失活[4]。近年來發現，BET蛋白家族是一類全新的轉錄調控蛋白，它們可以通過識別組蛋白上乙酰化的賴氨酸殘基并與之結合，從而募集轉錄激活子來實現染色質的乙酰化，而乙酰化的染色質可以促進轉錄激活，促進腫瘤發生發展。因此抑制BET蛋白家族可能抑制腫瘤進展，成為目前治療腫瘤的潛在新藥物靶點[5-6]。JQ1是一種BET bromodomain抑制劑，能夠特異性地與BRD4相競爭，結合到BET家族的所有溴結構域，而不結合到BET家族以外的溴結構域，從而將BRD4從染色質中釋放出來，抑制BRD4的轉錄調控作用[7]。目前認為JQ1可以誘導腫瘤細胞凋亡，抑制其侵襲、浸潤能力，進而抑制腫瘤細胞的生長，但具體機制不明[8]。體內外研究表明，JQ1對多種腫瘤細胞有抑制作用，尤其是造血來源腫瘤細胞[9]。然而JQ1對宮頸癌細胞的作用尚未見系統報道。因此，進一步探索JQ1對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響及可能的作用機制，對設計合理的治療藥物及判斷預后具有重要意義。本文旨在探討JQl對宮頸癌HeLa細胞的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌HeLa細胞系，由廈門生命互聯科技有限公司提供。BRD4抑制劑JQ1購于MCE(MedChemExpress)公司。JQ1使用前采用二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)稀釋并溶解，使JQ1儲存溶度調整至50mmol/L。DMEM培養基(High glucose with L-glutamine；with sodium pyruvate)購自美國Hyclone公司。胎牛血清購自PEAK公司；0.25%胰蛋白酶(Trypsin)購自Gibco公司；CCK-8試劑盒(cell counting kit-8)購自Biosharp公司。磷脂結合蛋白5-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)凋亡試劑盒及PI周期試劑盒購自聯科生物科技有限公司。反轉錄試劑盒由廈門生命互聯科技有限公司提供。細胞培養皿購自Corning公司；細胞培養箱購自美國Forma Scientific公司。采用的試驗儀器包括酶聯免疫檢測儀(酶標分析儀，Bio-Rad公司)；Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system(美國ABI公司)；倒置相差顯微鏡(日本尼康公司)等。

1.2 方法

1.2.1 宮頸癌HeLa細胞培養:采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養基培養宮頸癌細胞株HeLa細胞，將培養基置于含5%濃度的CO2、37℃、飽和濕度的孵箱中培養，隔天換液，每2～3d傳代1次，取對數生長期的HeLa細胞用于后續實驗。

1.2.2 藥物預處理:用DMSO將BRD4抑制劑JQ1溶解為儲存液備用，使用時給藥組根據試驗設計需求按濃度配制稀釋制劑，對照組加入等體積的DMSO處理細胞，并作為對照。

1.2.3 細胞增殖能力檢測:采用Cell Counting Kit-8(CCK8)法檢測JQ1對HeLa細胞株增殖的影響。待HeLa細胞生長至70%～80%時，采用0.25%的胰酶消化培養的HeLa細胞。采用離心機對細胞液進行離心處理后重新將培養基加入沉渣細胞，將培養基中的細胞濃度調整至5×103個/100μl。細胞計數符合要求后，在96孔板上接種細胞，每孔接種100μl細胞懸液。繼續培養細胞24h，待細胞貼壁后，棄去殘留培養基，分別加入不同濃度的JQ1(分別為0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L)，處理24、48、72、120h。此外，空白對照組只加JQ1和培養基，而對照組不加JQ1只加HeLa細胞及培養基。經過充分時間的培養后，在96孔板中重新加入含100μl新培養基，震蕩均勻后，加入10μl CCK8試劑充分接觸。藥物與細胞充分接觸2h后，測量樣本采用酶標儀測量450nm波長處的吸光度值(A值)，并通過以下公式計算不同JQ1濃度對HeLa細胞增殖的抑制率。細胞抑制率的計算公式為：抑制率(%)=[(A對照-A空白)-(A試驗-A空白)]/(A對照-A空白)×100%。

1.2.4 細胞凋亡檢測：根據CCK8試驗結果，采用流式細胞術檢測HeLa細胞凋亡。本研究采用0.5μmol/L和1μmol/L的JQ1作為藥物干預措施，并設置對照組(只加入DMSO)進行流式細胞術檢測。將HeLa細胞懸液的細胞密度調整至5×103個/100μl，隨后采用移液槍接種于6孔板上，待細胞生長融合度達70%～80%時，加入預先配置藥物，包括DMSO溶液、0.5μmol/L JQ1和1μmol/L JQ1。所有細胞混液繼續培養48h，隨后收集三組細胞懸液，加入預冷的磷酸鹽(PBS)緩沖液洗滌細胞懸液2遍，最后采用250μl結合液沖洗細胞懸液，并將細胞懸液的細胞濃度調整至1×106個/ml。采用單道移液槍移取100μl的細胞懸液，并吹入5ml的流式管。沿流式管壁輕輕加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI溶液，輕輕搖勻細胞懸液，于室溫、避光條件下孵育15min，最后往流式管加入400μl PBS，混勻后，上流式細胞儀分析。

1.2.5 細胞侵襲能力檢測：采用細胞劃痕試驗檢測JQ1對HeLa細胞的侵襲能力的影響。將HeLa細胞接種于6孔板中，待細胞生長至70%～80%后，利用200μl移液槍頭進行垂直劃痕。使用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗3次。細胞分為給藥組和對照組，給藥組JQ1的藥物濃度為1μmol/L，對照組加入同等體積的DMSO，置于孵箱中孵育，分別在0h和48h時鏡下觀察細胞的遷移情況并采集圖片。

1.2.6 不同藥物濃度JQ1處理對c-Myc及Bcl-2基因表達的影響：基于實時熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測c-Myc及Bcl-2基因表達情況。將培養合格的HeLa細胞接種于6孔板，待細胞生長至70%～80%，分別采用DMSO、0.5μmol/L JQ1和1μmol/L JQ1處理HeLa細胞48h。之后充分研碎細胞，加入相同體積的Trizol試劑(異硫氰酸胍)提取HeLa細胞RNA。根據反轉錄試劑盒的說明書進行試驗操作。將提取液中的RNA逆轉錄成cDNA，然后根據PCR試劑盒說明書，以c-Myc及Bcl-2特定引物，在實時定量熒光PCR儀中以cDNA為模板進行聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)擴增。PCR反應體系為20μl，反應條件為95℃反應2min；95℃15s，60℃40s，試驗共完成45個循環。在60℃條件下獲取熒光信號。循環反應結束后將反應溫度從65℃升高至95℃從而獲得熔解曲線。本試驗以GAPDH為內參，并根據各組測得的循環閾值Ct計算mRNA的相對表達量(mRNA相對表達量=2-ΔΔCt)。

2 結果

2.1 CCK8法檢測JQ1對HeLa細胞增殖影響 JQ1對HeLa細胞有顯著的增殖抑制作用，且呈劑量及時間依賴性(見表1)。在相同的作用時間下，JQ1對HeLa細胞的抑制隨著濃度的增加而顯著增加(P<0.05)。在相同濃度作用下，JQ1對HeLa的生長抑制作用隨著處理時間的延長而增加(P<0.05)。在0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L三種濃度試驗條件下，JQ1對HeLa細胞24、48、72和120h的IC50分別為8.702mmol/L、11.91mmol/L、1.063mmol/L、0.134mmol/L。

表1 不同濃度、不同時間JQ1對宮頸癌HeLa細胞增殖影響

2.2 JQl促進HeLa細胞株凋亡分析 48h后采用流式細胞儀分析細胞凋亡，對照組HeLa細胞凋亡率為20.38%，而0.5μmol/L JQ1組和1μmol/L JQ1組凋亡率分別為26.90%和40.33%，組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.3 JQ1抑制HeLa細胞株侵襲 本文采用劃痕試驗驗證JQ1對HeLa細胞的侵襲能力是否有影響，我們采用濃度為1.0μmol/L的JQ1處理HeLa細胞株，對照組采用DMSO處理，結果顯示JQ1對HeLa細胞的侵襲能力產生顯著的抑制作用，見圖1。

圖1 JQ1抑制HeLa細胞株侵襲的細胞劃痕試驗

2.4 JQ1對HeLa細胞株中c-Myc及Bcl-2 mRNA表達量的影響 在2.1 CCK8試驗結果中，1μmol/L的JQ1處理HeLa細胞株72h可以達到50.82%的抑制，因此對HeLa細胞生長影響較少。后續本研究采用濃度為0.5μmol/L、1μmol/L的JQl處理HeLa細胞株來進一步進行凋亡基因的表達量檢查。藥物處理48h后提取總RNA并用qRT-PCR法檢測JQ1對c-Myc及Bcl-2表達量的影響。結果顯示經JQ1處理后的HeLa細胞c-Myc及Bcl-2表達量下降，并且隨著JQl濃度的增加mRNA表達量逐漸下降，出現劑量依賴性(見表2)。

表2 BRD4抑制劑JQ1對HeLa細胞株中c-Myc及Bcl-2mRNA相對表達量影響

3 討論

宮頸癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，其治療模式和療效很大程度取決于腫瘤分期和病理類型[10]。早期宮頸癌給予根治性手術往往可以獲得很好的療效[11]，但中晚期宮頸癌占新確診宮頸癌的比例則高達50%～60%，其治療模式為根治性放化療[12]。接受根治性放化療的患者，30%～35%的患者會出現腫瘤局部復發或遠處轉移，這部分患者以全身化療為主要治療手段，但療效差，5年生存率不足40%[12]。迄今為止，靶向治療和免疫治療在宮頸癌中的應用證據極為有限[13]。晚期宮頸癌多采用化療控制，但療效極差，生存期短。因此，積極尋找針對宮頸癌的高效靶向藥物具有重要的現實意義。

JQ1是一種BRD4小分子抑制劑，可以高度選擇性地結合到BRD4結構域上，發揮競爭性抑制作用，目前JQ1在多種實體腫瘤中得到了廣泛的研究。盡管JQ1作為單一藥物應用于某些腫瘤的治療尚處于Ⅱ期研究階段，但JQ1對多種不同遺傳背景的惡性腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，但在JQ1抑制宮頸癌侵襲和轉移方面，目前研究較少[14]，并且關于BRD4參與宮頸癌發生發展的機制研究也很少[15]。在口腔鱗癌Cal27系研究中發現，JQ1可以抑制腫瘤的增殖、侵襲、轉移， JQ1可能是一種治療口腔鱗癌的新藥[16]。另一項研究發現，BRD4的過度激活可以促進前列腺癌細胞上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，從而促進前列腺癌細胞轉移[17]。在乳腺癌研究中發現，JQ1主要通過抑制c-Myc的表達來抑制腫瘤增殖，但在侵襲、轉移等惡性生物學行為的作用具體機制還未明確，值得深入研究[18]。

隨著研究深入，BET抑制劑發揮靶向抗腫瘤作用的機制逐漸清楚。目前認為，BET抑制劑通過特異性地調節許多基因的表達來發揮抗腫瘤作用[18]。c-Myc和Bcl-2是調節細胞增殖和存活的關鍵蛋白，其相關基因的異常改變是癌癥最重要的生物學特征[19]。在宮頸癌中的研究表明，BRD4抑制劑可以通過抑制HPV16 E6的表達，從而增強腫瘤細胞對化學治療的反應，因此有望成為宮頸癌治療的潛在新靶點[20]。miRNA可能是參與BRD4生物學調控網絡的重要分子。一項研究發現，宮頸癌組織中，miR-152-5p下調而BRD4上調；熒光素酶定位分析顯示，miR-152-5p可以直接與HeLa細胞和CaSki細胞中的BRD4結合[15]。因此，通過調節miR-152-5p/BRD4軸，可以有效抑制 HeLa和 CaSki細胞的增殖、侵襲和EMT轉化[15]。

本研究中，筆者通過體外試驗，初步探討了JQ1作為BET蛋白抑制劑在宮頸癌HeLa細胞中的抗癌效應。目前關于JQ1抑制宮頸癌HeLa細胞的體外研究尚未見報道。從CCK8法試驗結果來看，JQ1在體外發揮抗腫瘤效應具有濃度依賴性和時間依賴性，即隨著濃度的增加或時間的延長，其抗腫瘤效應明顯增強，可以有效抑制HeLa細胞的增殖，這與JQ1在其他實體腫瘤中的效應是一致的[21]。流式細胞凋亡分析顯示，與對照組相比，經過JQ1處理的HeLa細胞株更容易發生凋亡；且其促進凋亡的生物效應隨JQ1濃度增加而明顯提高，說明JQ1促進HeLa細胞凋亡具有濃度依賴性[22]。細胞劃痕試驗提示，JQ1可以有效抑制HeLa細胞的侵襲行為。上述基礎實驗表明，JQ1可以有效抑制HeLa細胞的惡性生物學行為，但目前筆者尚未檢索到JQ1應用于宮頸癌抗腫瘤治療的臨床研究，也尚不清楚JQ1抗腫瘤效應的具體機制。在其他腫瘤中的研究表明，JQ1可能通過調節c-Myc和Bcl-2等蛋白的表達發揮抗腫瘤效應[22]。可以確定的是，c-Myc蛋白是影響腫瘤細胞生物學功能最重要的生物蛋白，如細胞增殖、凋亡、侵襲性等。c-Myc基因表達的下調不僅本身可以抑制癌細胞的增殖，還可以通過誘導抗凋亡基因Bcl-2表達的降低而促進細胞凋亡[23]。在本研究中，筆者通過qRT-PCR實驗證實，JQ1同樣通過調節c-Myc和Bcl-2等蛋白的表達發揮抑制HeLa細胞的生物學行為，這與其他腫瘤的基礎研究結果一致[24]。從筆者的研究結果來看，隨著JQ1濃度的增加，癌基因c-Myc和Bcl-2表達逐漸下降，進一步證實JQ1抗腫瘤效應具有濃度依賴性，且c-Myc和Bcl-2是JQ1發揮抗腫瘤效應的關鍵生物分子之一[25]。本研究為本課題項目的初步結果，下一步，筆者將通過LncRNA和circRNA等方面深入探討JQ1對HeLa細胞的作用機制。

綜上所述，BRD4抑制劑JQ1可以有效抑制宮頸癌HeLa細胞的增殖和侵襲能力，促進HeLa細胞凋亡，其可能機制與降低癌基因c-Myc及抗凋亡基因Bcl-2的表達有關。基于本研究，JQ1可能是一種對宮頸癌具有潛在抗腫瘤能力的藥物，值得在臨床上開展試驗進一步證實。