棉花枯萎病菌及其培養條件篩選

劉艷, 鮑紅帥, 尚紅燕, 王國寧, 張艷, 王省芬, 馬峙英, 吳金華

（河北農業大學農學院, 華北作物改良與調控國家重點實驗室, 河北省作物種質資源重點實驗室, 河北保定 071000）

棉花枯萎病是土傳性的維管束病害, 能夠在棉花的整個生育期為害。病輕時葉片褪綠變黃, 病重時葉片干枯、脫落, 植株死亡[1-2]。1891年在美國阿拉巴馬州發現了棉花枯萎病[3], 20世紀70年代該病已經發展為棉花的主要病害[4], 嚴重影響著棉花的生產與發展。

枯萎病由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum f.sp.Vasinfectum)引起[5]。病原菌從根部侵入后在棉花植株的表皮細胞間生長；當菌絲體進入木質部導管后大量繁殖, 在導管中縱向或橫向生長刺激鄰近的薄壁細胞產生膠狀物質等阻塞導管；導管中的菌絲體可以通過紋孔侵入到維管束組織影響水分和養分的運輸, 從而導致植株萎蔫死亡[6]。棉花枯萎病病原菌抗逆性強、致病性變異較大, 并可以通過多種途徑傳播, 所以很難防治[7]。

枯萎病菌的種類、培養溫度和時間及不同的營養成分等對其生長影響很大。劉冬梅[8]研究發現, 菌株的最適生長溫度為28℃, 最適生長pH為7~12。曹君等[9]研究發現, 以蔗糖作為碳源, 尖孢鐮刀菌分生孢子產孢量最大。高婧等[10]研究結果顯示, 向日葵中分離的輪枝鐮刀菌生長的速度最快、產孢量最多, 磚紅鐮刀菌的生長速度最慢。李云卿等[11]研究發現, 主要成分為雞糞沼液的新壯態生長促進液對病原菌菌絲的生長、分生孢子的萌發以及產孢量有明顯的抑制作用。

有關棉花枯萎病菌培養及其營養生理方面迄今鮮有報道, 其他植物枯萎病菌培養的研究主要集中于碳、氮含量培養基的研究上。本研究通過對棉花枯萎病菌培養條件的探索, 以期篩選出致病力強的枯萎病菌并明確其適宜的培養條件, 為棉花枯萎病抗性鑒定及枯萎病抗病育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用菌種均為枯萎病菌7號生理小種, 包括實驗室保存的來源于河北曲周、河北雞澤、河北保定和新疆烏魯木齊（分別命名為QF、JF、BF、WF）, 以及中國農業科學院植物保護研究所簡桂良研究員提供的枯萎病菌（PF）；感病品種冀棉11由河北農業大學棉花遺傳育種團隊提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同枯萎病菌菌系產孢數及致病力鑒定不同來源的枯萎病原菌培養在PDA培養基上[12], 直至菌絲長滿平皿, 將病原菌接種至液體土豆培養基中, 在恒溫培養箱中振蕩培養（25℃、170 r·min-1）, 于2、3、4和5 d分別統計其產孢量并觀察孢子形態。

產孢量統計及形態觀察：取潔凈的25格×16格的血球計數板, 在超凈工作臺中用移液槍吸取少許菌液滴入血球計數板的計數區, 蓋上蓋玻片靜置片刻, 將血球計數板放置于顯微鏡下（OLYMPUS-BX51）觀察孢子形態, 數5個方格中的孢子數量, 統計總體產孢量。

種苗前, 首先將無菌蛭石裝進營養缽備用, 種子于28℃浸泡約10 h, 然后放入2層無菌紗布間過夜催芽, 待種子露白后挑選發芽整齊一致、生長狀態良好的種子種植于溫室備好的營養缽中。種苗10 d左右, 待棉苗長至兩葉一心時接種枯萎病菌。將培養好的枯萎病菌在超凈工作臺中接種于液體培養基中, 恒溫振蕩培養的菌液用雙層紗布過濾, 用清水將懸浮液孢子含量調至1×107cfu·mL-1, 進行接菌, 每盆接菌300 mL。接菌25～30 d時觀察棉苗的發病情況。根據病害發生的部位及發病程度[13], 將棉花枯萎病分為5級, 記為0、1、2、3、4（表1）。

表1 分級標準Table 1 Grading criteria

1.2.2 枯萎病菌液體培養基的篩選 試驗設置8種不同的液體培養基（PD-50、PD-75、PD-100、PD-150、PD-200、PS-75、PS-200和Czapek）, 具體配方見表2。培養基在高壓滅菌鍋中滅菌（121℃, 20 min）, 待培養基冷卻, 在超凈工作臺中將致病力強的枯萎病菌接種于8種不同的液體培養基中, 恒溫振蕩培養（25℃、170 r·min-1）, 在1、2、3、4、5和6 d分別統計產孢數。

1.2.3 不同固體培養基菌落生長速率的測定 設置4種固體培養基（PDA-75、PSA-75、PSA-200和Czapek）處理, 在表2基礎上添加瓊脂（15 g·L-1）。固體培養基高壓滅菌（121℃, 20 min）, 在超凈工作臺中分裝至平皿, 待培養基凝固備用, 將致病力強的枯萎病菌用5 mm的打孔器打成菌餅置于平皿中, 放置在25℃恒溫培養箱中暗培養。每個處理設置3次重復, 從培養2 d時開始觀測, 每天觀測菌落表型及菌落直徑, 連續觀測5 d, 每個重復用十字交叉法測量4次。

表2 不同液體培養基配方Table 2 Formulation of different Liquid culture media （g·L-1）

1.2.4 不同固體培養基上枯萎病菌產孢量統計待1.2.3中培養的病原菌長滿平皿時, 在超凈工作臺中將其分別接種到Czapek液體培養基中振蕩培養（25℃、170 r·min-1）, 分別于2、3、4、5和6 d統計其產孢數。

1.2.5 枯萎病菌培養天數 將枯萎病菌分別接種到PD-75和Czapek培養基中培養, 通過顯微鏡每天觀察產孢數, 連續觀察10 d, 并記錄孢子數量。

1.2.6 培養溫度對產孢量的影響 在25和30℃條件下, 將枯萎病菌分別接種到液體培養基中進行振蕩培養, 于2、3、4、5和6 d統計其產孢數并記錄。

2 結果與分析

2.1 不同枯萎病菌菌系產孢數及致病力分析

對不同來源的枯萎病原菌進行培養并統計產孢數, 結果表明, 5個菌培養3～4 d孢子數達到最高, 顯著高于2和5 d。QF、WF和PF孢子數最高達108cfu·mL-1、BF最高達109cfu·mL-1、JF最高達107cfu·mL-1；QF、JF和BF為小型分生孢子, 卵圓形或腎臟形；WF是鐮刀型和腎臟形混合；PF為大型分生孢子, 鐮刀型, 略彎曲。

用這些孢子懸浮液接種棉花枯萎病感病對照冀棉11, 結果（圖1）表明, 接菌JF和BF后35 d, 棉苗仍然沒有發病癥狀；接菌QF和WF后35 d部分子葉有發黃癥狀；接菌PF后25~30 d出現失綠、干枯等枯萎病癥狀。因此, 選擇PF進行枯萎病抗性鑒定。

圖1 不同枯萎病菌產孢量、孢子形態及致病力Fig.1 Sporulation, spore morphology and pathogenicity of different Fusarium oxysporum

2.2 不同液體培養基產孢數分析

8種液體培養基接種枯萎病菌后產孢數結果（表3）表明, Czapek培養基產孢數顯著高于其他培養基, 其次為PD-75；PD-50和PS-75之間差異不顯著；PD-100、PD-150和PD-200之間差異不顯著；PS-200總產孢量最少。總體來看, 培養4 d產孢數的平均值最大, 顯著高于其他培養天數, 培養3和5 d之間產孢量差異不顯著, 培養1 d的產孢數最少（圖2）。因此, 選擇Czapek培養4 d的孢子進行接菌為宜。

表3 不同培養基孢子數顯著性分析Table 3 Significance analysis of the number of spores in different media

圖2 不同培養時間8種培養基孢子數平均值變化Fig.2 Average number of Fusarium oxysporum spores by 8 culture media at different time

2.3 不同固體培養基對菌落生長速率和生長狀態的影響

枯萎病菌PF在4種固體培養基上培養, 連續6 d觀察其生長速率, 由表4可知, PDA-75、PSA-75和PSA-200的平均生長速率分別為0.86、0.87和0.91 cm·d-1, 三者之間生長速率差異不顯著。Czapek固體培養基上的生長速率為1.29 cm·d-1, 其生長速率要顯著高于其他3種培養基。

表4 不同固體培養基菌落生長速率比較Table 4 Comparison of growth rates of colonies in different solid media

在PDA-75、PSA-75、PSA-200和Czapek固體培養基上培養枯萎病菌, 連續觀察菌落生長狀態, Czapek培養基上6 d左右可長滿平皿, 其余培養基培養12 d左右即可長滿平皿。菌落培養12 d后的形態觀察顯示, PDA-75氣生菌絲生長初期菌絲紫色絨狀, 生長后期分泌色素較多, 紫色加深, 菌絲平鋪在培養基上；PSA-75氣生菌絲絨狀, 顏色呈現淡紫色, 后期顏色變深, 菌絲稀疏；PSA-200氣生菌絲為白色的致密羊毛狀, 生長后期顏色沒有發生變化；Czapek上生長的氣生菌絲為白色薄絨狀, 菌絲較稀疏, 后期有較少的絨毛狀菌絲生成, 顏色變為淡黃色（圖3）。

圖3 不同固體培養基培養菌落6和12 d后的菌落形態比較Fig.3 Comparison of colony morphology after culturing colonies on different solid media between 6 and 12 d

2.4 不同固體培養基對枯萎病菌產孢量的影響

將2.3中4種固體培養基培養的病原菌分別接種至Czapek液體培養基中, 連續6 d觀察枯萎病菌在液體培養基中的產孢數。結果（圖4）表明, 培養在PSA-200固體培養基上的枯萎病菌在Czapek液體培養基中總產孢量最大, Czapek固體培養基上培養的枯萎病菌接種在其液體培養基中總產孢量最少；PSA-200固體培養基上培養的枯萎病菌接種到Czapek液體培養基中的產孢量與PDA-75之間差異不顯著, 但顯著高于PSA-75和Czapek（表5）。

表5 不同固體培養基產孢數的差異顯著性分析Table 5 Significance analysis of the difference in the number of spores produced by different solid media

圖4 不同固體培養基培養病菌產孢數變化Fig.4 Changes in the number of spores of pathogens cultivated in different solid media

2.5 接菌后不同培養時間之間產孢數分析

為進一步明確適宜的培養天數, 將枯萎病菌在PD-75和Czapek中連續培養10 d。結果（圖5和表6）表明, Czapek培養4 d孢子數最多, 其次為7 d, 培養4和7 d孢子數之間差異不顯著, 但它們顯著高于其他培養天數；培養3、6和8 d之間差異不顯著, 5、9和10 d之間差異不顯著, 但顯著高于1和2 d孢子數。

表6 枯萎病菌在Czapek和PD-75培養基不同培養天數之間產孢數的差異顯著性分析Table 6 Significance analysis of number of spores between different culture days on different media

圖5 枯萎病菌在Czapek和PD-75培養基連續培養10 d的孢子數動態變化Fig.5 Dynamic change of Fusarium oxysporum spores for 10 d on medium Czapek and PD-75

枯萎病菌在PD-75培養基接菌后孢子數變化結果表明, 培養4 d的孢子數最多, 依次為6、8和7 d, 且4和6 d之間差異不顯著, 7和3 d之間差異不顯著, 5、9和10 d之間差異不顯著, 接菌后1 d孢子數最少。

基于上述結果并結合實際需要, 進一步確認選擇培養4 d的孢子進行接菌為宜。

2.6 不同溫度對枯萎病菌產孢數分析

2種溫度培養的枯萎病菌孢子數統計結果（圖6）顯示, 接菌后25和30℃培養枯萎病菌, 培養3、4、5和6 d產孢數無顯著差異。

圖6 不同溫度下枯萎病菌產孢數變化Fig.6 Number of spores under different temperatures

3 討論

病原菌的生物學特性研究對抗病育種以及病害防治極其重要。本研究結果表明, 不同來源枯萎病菌產孢量、孢子大小形態以及致病力均存在差異。仇存璞等[14]研究顯示不同芝麻主產區不同菌株致病力不同。過崇儉等[15]研究表明, 棉花枯萎病菌不同專化型“南京型”和“啟東型”大型分生孢子和小型分生孢子的大小形態不同。本研究的5個枯萎病菌7號生理小種產孢數之間的差異可能與不同來源的病原菌生長所需要的營養成分不同有關, 這與李金峰等[16]研究結果一致。培養過程中所用的菌餅大小及活性之間的誤差可能對試驗結果也有一定的影響, 但總的產孢趨勢不受影響。

本研究表明, 病原菌在Czapek固體培養基上生長速率最快, 在PSA-200固體培養基培養的病原菌產孢量最大, 這2種培養基都以蔗糖為碳源。這與蔡悅等[17]和馮雪等[18]研究的大多合歡枯萎病菌菌株在蔗糖為碳源的培養基上生長速度較快的結果一致。鄭莉等[19]研究發現, 草莓枯萎病菌以葡萄糖為碳源和以硝酸鈉為氮源的培養基上菌落生長速率快, 本研究與該結論相似, 差異之處可能是由于植物種類的不同造成的。供試菌株在Czapek培養基中產孢量要高于其他培養基, 該培養基以蔗糖作為碳源, 這與曹君等[9,20]研究以蔗糖作為碳源時產孢量最大的結論基本一致。但李金峰等[16]研究的南瓜枯萎病原菌以淀粉為碳源時產孢量大。本研究以葡萄糖和蔗糖為碳源, 且設置了不同的濃度, 其產孢量之間也表現出差異, 說明枯萎病菌產孢量的多少可能與碳源濃度以及培養基中其他成分的含量也有關系。將枯萎病菌在PD-75和Czapek液體培養基中連續培養10 d, 篩選出4 d孢子數最多且為適宜的培養天數。秦涵淳等[21]研究的全糖型和尿素型培養基在6 d時產孢量最大；肖榮鳳等[22]研究的淀粉型培養基5 d后產孢量開始下降。造成這一差異的主要原因可能是培養基成分影響著產孢量的速度。本研究中培養溫度25和30℃之間產孢量差異不顯著, 這與前人研究的最適溫度在27~30℃之間的結論基本一致[8,23]。沈文淵[24]研究了瓜類枯萎病菌4種專化型的最適生長溫度為25~31℃之間；高婧等[10]研究的枯萎病菌株的最適生長溫度為25~30℃。

本研究篩選出了對棉花枯萎病致病力強的病原菌PF；明確了Czapek液體培養基產孢數顯著高于其他培養基；病原菌在Czapek固體培養基上的生長最快, 但在PSA-200固體培養基上總產孢量最大；進一步確認了枯萎病菌培養4 d孢子量最大；揭示了培養溫度25和30℃之間產孢量差異不顯著, 對棉花枯萎病抗病育種及種質資源的枯萎病抗性鑒定奠定了基礎。