產脂肪酶菌株篩選及其抗氧化性的研究

王 吉， 張 鑫， 胡靜榮， 于智慧， 朱迎春

(山西農業大學食品科學與工程學院，晉中 030800)

發酵肉制品是指將禽畜肉或水產品等原料按照一定的肥瘦比例進行絞碎，與鹽、糖、亞硝酸鈉、發酵劑和香辛料等混合均勻后，在特定條件下利用微生物發酵制成的一種具有特殊發酵風味、營養豐富、易于保存的肉制品[1]。

脂質是發酵肉制品的重要成分之一，肉制品在發酵成熟過程中，脂質降解產生游離脂肪酸，尤其是多不飽和脂肪酸，極大提高了發酵香腸的營養價值[2]。脂肪降解產生的游離脂肪酸經過氧化作用生成羰基化合物，從而產生了醇類、酮類、醛類等風味物質[3]。有研究表明[4, 5]，脂肪酶通過催化肉制品中脂質的分解，提高了游離脂肪酸的含量，從而促進風味前體物質的產生。在發酵過程中，微生物對脂質的水解起著重要的作用。李想等[6]發現腐生葡萄球菌可以促進發酵肉中脂質的水解。劉英麗等[7]報道了乳酸菌在薩米拉發酵香腸中的作用，指出乳酸菌可以促進香腸中脂質的降解。Xiao等[8]報道接種植物乳桿菌和木糖葡萄球菌可以促進游離脂肪酸的釋放。脂質適度的氧化，有助于發酵肉制品風味的形成[9]。然而，脂質的過度氧化會導致產品酸敗、質地和顏色的改變、微生物的生長、食用品質的降低和保質期的縮短[10]。有研究人員通過在制作發酵肉制品中添加一些抗氧化劑來抑制脂質的過度氧化[11]。也有研究人員采用具有抗氧化性的菌株作為發酵劑來抑制脂質的過度氧化，如韓飛云等[12]報道，在發酵羊肉香腸中接種復配發酵劑(木糖葡萄球菌和植物乳桿菌)可以顯著降低TBARS值。

本實驗從實驗室保藏的12株發酵菌株中篩選具有產脂肪酶的菌株，對菌株表達脂肪酶的基因進行定性和定量分析，研究培養基初始pH、培養溫度、時間、接菌量對油脂降解率的影響，并對菌株進行抗氧化分析，旨在篩選出同時具備脂解能力和抗氧化活性的菌株，為提高發酵香腸的營養價值和改善發酵香腸的風味提供技術支持，為開發具有我國自主知識產權的新型發酵劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

山西農業大學食品科學與工程學院畜產品實驗室保藏的12株菌株，前期經過分離、純化和16S rDNA鑒定，種屬關系明確，分別為：2株戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)MGC2、MSZ1， 3株巨球菌(Macrococcuscaseolyticus)YZC2、YZC3、YXN2，2株木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)YSZ11、YCC3，1株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)MSZ2，1株表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)MYJC2，2株腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)YCC2、YRC1，1株屎腸球菌(Enterococcusfaecium)MRC2。

無水乙醇、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、沒食子酸、水楊酸均為分析純；RNA試劑盒、TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ定量試劑盒、反轉錄試劑盒。

1.1.2 培養基

中性紅油脂培養基(g/L)：NaCl 5 g，蛋白胨10 g，大豆油10 g，牛肉膏5 g，1.6%中性紅1 mL；MRS培養基、三丁酸甘油酯培養基、營養肉湯培養基、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉。

1.1.3 設備與儀器

5804R高速冷凍離心機，HPP-9272電熱恒溫培養箱，ST2100 pH計，UV-1100分光光度計，SW-CJ-2FD雙人單面超凈化工作臺，LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌器，LC96實時定量 PCR 儀，NanoDrop2000核酸蛋白分析儀。

1.2 方法

1.2.1 菌株產脂肪酶能力篩選

參照Griebeler等[13]的方法，利用中性紅油脂平板法和三丁酸甘油酯平板法篩選具有產脂肪酶能力的菌株。

1.2.2 菌株脂肪酶基因相關基因表達量的檢測

用細菌RNA提取試劑盒提取菌株RNA，并用核酸蛋白分析儀對RNA濃度和純度進行檢測。將所提取的RNA反轉錄成cDNA，保存于-20 ℃備用。經過NCBI查詢，葡萄球菌和巨球菌編碼脂肪酶的相關基因為FJ979867.1、FJ979868.1、AY551101.1。進行設計并合成相應的引物，實時定量PCR引物見表1。3個基因為實驗基因，18S為內參基因，cDNA作為模板進行定量PCR擴增，反應體系為： 25 μL TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ，2 μL上游引物，2 μL下游引物，2 μL cDNA，R Nase Free dH2O 19 μL[14]；PCR反應條件見表2。采用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。

表1 實時定量PCR引物

表2 PCR反應條件

1.2.3 初始pH對菌株產脂肪酶的影響

篩選出的菌株在營養肉湯中培養48 h，將菌株稀釋到8 log10CFU/mL后接種到pH分別為5、6、7的三丁酸甘油酯平板中，在37 ℃下培養48 h。測量透明圈的大小來判定pH對菌株產脂肪酶能力的影響。

1.2.4 菌株培養溫度對油脂降解率的影響

篩選出的菌株在營養肉湯中培養48 h，稀釋到8 log10CFU/mL后按體積分數為0.2%分別接種到含有質量分數為2%油脂的營養肉湯中，在不同溫度(27、32、37、42 ℃)下培養48 h，然后用25 mL石油醚對油脂萃取3次，收集有機相并且用無水硫酸鈉吸取殘留的水分，用旋轉蒸發儀去除有機溶劑，然后置于(60±2)℃的烘箱中烘干，稱量剩余油脂的質量。計算公式為：

1.2.5 菌株培養時間對油脂降解率的影響

篩選出的菌株在營養肉湯中培養48 h，將其稀釋到8 log10CFU/mL后按體積分數為0.2%分別接種到含有質量分數為2%油脂的營養肉湯中，在37 ℃下培養，分別在24、36、48、60 h測定油脂的降解率。

1.2.6 接菌量對油脂降解率的影響

篩選出的菌株在營養肉湯中培養48 h，稀釋到8 log10CFU/mL后分別按照按體積分數為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的接種量接種到含有質量分數為2%油脂的液體培養基中，在37 ℃下培養48 h測定油脂的降解率。

1.2.7 菌株發酵液抗氧化性分析

參照李權威等[15]的方法進行測定。在營養肉湯中接種體積分數為2%篩選出的菌株，37 ℃培養48 h后離心(10 000 g，15 min)得到上清液，進行抗氧化指標測定。DPPH自由基清除率參照馮美琴等[16]的方法測定。羥自由基清除率參照王靜等[17]的方法測定。超氧陰離子自由基清除率參照Fonagy等[18]的方法測定。總還原力測定參照馮艷鈺等[19]的方法測定。

1.2.8 數據處理與分析

所有實驗均做3個平行，結果以平均數值±標準差表示。通過Statistix 8.1 進行顯著性差異分析(顯著水平為P<0.05)；通過Origin 9.0軟件繪制圖片。

2 結果與分析

2.1 產脂肪酶菌株的初篩結果

通過油脂中性紅平板顏色的變化可定性分析菌株是否具有產脂肪酶的能力[20]。如果平板顏色未發生變化，說明菌株產酶能力弱或者不具備產酶能力；如果平板顏色發生變化，說明該菌可以分泌脂肪酶，油脂在脂肪酶的作用下分解成脂肪酸，使平板顏色變為紅色。產脂肪酶定性實驗結果見表3。菌株YZC2、YSZ11、YCC3、YZC3、YCC2可以使中性紅平板變為紅色，說明這5株菌株具有分泌脂肪酶的能力；菌株MGC2、MRC2、YXN2、MSZ1、MSZ2、YRC1、YMJC2未使中性紅平板變色，說明這7株菌分泌脂肪酶的能力弱或不具備分泌能力。

表3 產脂肪酶定性實驗結果

2.2 產脂肪酶菌株的復篩結果

菌株產脂肪酶能力實驗見表4，5株菌株均能夠分解三丁酸甘油酯產生透明圈，5株菌株的透明圈直徑與菌落直徑比值(D/d)為1.78～2.29，其中菌株YCC3、YZC2、YCC2D/d值>2，說明脂肪酶活力較強，特別是菌株YCC3的D/d值最高，達到2.29。故選取YCC3、YZC2、YSZ11、YZC3、YCC2這5株菌株進行后續實驗。

表4 菌株產脂肪酶能力實驗

2.3 菌株編碼脂肪酶基因表達量分析

從NCBI上查閱到葡萄球菌和巨球菌編碼脂肪酶的基因并對菌株DNA進行了擴增，只對FJ979867.1、 AY551101.1、FJ979868.1這3種基因擴增成功。由表5可見，含有編碼脂肪酶基因FJ979867.1的菌株有YCC2、YCC3；含有編碼脂肪酶基因 AY551101.1的菌株有YSZ11、YCC2、YCC3、YZC3；含有編碼脂肪酶基因FJ979868.1的菌株有YSZ11、YCC2、YCC3、YZC2、YZC3。

表5 5株菌株編碼脂肪酶相關基因的定性結果

菌株脂肪酶基因的相對表達量如圖1所示，FJ979867.1的相對表達量在菌株YCC2中最高，顯著高于菌株YCC3(P<0.05)，但是在其他3株菌株中均無表達。FJ979868.1在菌株YCC2、YCC3、YSZ11、YZC3中相對表達量在0.309～0.570之間，在菌株YZC2中無表達。AX551101.1在5株菌株中均有所表達，且YCC2和YSZ11的表達量顯著高于其他3株菌株(P<0.05)。5株菌株比較，菌株YCC2的3種脂肪酶基因均有所表達，尤其是FJ979867.1和AX551101.1的相對表達量顯著高于其他菌株(P<0.05)。

注：不同大寫字母表示不同菌株對FJ979867.1 的表達量差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母不同菌株對FJ979868.1的表達量差異顯著(P<0.05)；*、**分別表示不同菌株對AX551101.1 的表達量差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)；NS表示沒有檢出該基因。圖1 菌株脂肪酶基因的相對表達量

2.4 pH對菌株產脂肪酶能力的影響

不同pH對菌株產脂肪酶能力的影響如圖2所示，5株菌株脂肪酶活力隨著pH的下降而降低。pH為7時，菌株YZC3、YCC3、YCC2、YSZ11、YZC2D/d值分別1.88、2.18、2.18、1.51、1.55，說明5株菌株在pH為7時具有較高的脂肪酶活性；pH為6時，5株菌株D/d值降低為1.34(YZC3)、1.53(YCC3)、1.81(YCC2)、1.35(YSZ11)、1.36(YZC2)，顯著低于(P<0.05)pH為7時的D/d，說明在此條件下，菌株分泌脂肪酶的能力降低且酶活性降低；當pH為5時，僅有菌株YCC2出現透明圈，D/d值為1.57，而菌株YZC3、YZC2、YCC3、YSZ11均未出現透明圈，說明YCC2耐酸性較強，在pH為5時仍舊能夠分泌脂肪酶且表現出較高的活力；而其余4株菌株在pH為6～7時，生長代謝較為活躍，產酶量較高，并且所產脂肪酶有較高活性，但是當pH降低為5時，菌株生長代謝能力減弱，產酶量降低或消失。

注：不同大寫字母表示相同pH不同菌株之間D/d差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示菌株在不同pH D/d差異顯著(P<0.05)。圖2 不同pH對菌株產脂肪酶能力的影響

2.5 培養溫度對油脂降解率的影響

培養溫度對油脂降解率的影響如圖3所示。5株菌株隨著培養溫度的升高油脂降解率均呈現先上升后下降的趨勢。溫度對菌株YCC2、YCC3的油脂降解率影響顯著(P<0.05)，并且在37 ℃時油脂降解率達到最高，分別為57.34%(YCC2)和49.71%(YCC3)。培養溫度為32～37 ℃時，YZC3、YSZ11油脂降解率維持在較高水平，而菌株YZC2在32 ℃下培養油脂降解率最高，達到16.12%。

注：不同大寫字母表示相同培養條件不同菌株之間油脂降解率差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示菌株在不同培養條件油脂降解率差異顯著(P<0.05)，下同。圖3 培養溫度對油脂降解率的影響

2.6 培養時間對油脂降解率的影響

培養時間對油脂降解率的影響如圖4所示，隨著培養時間的延長，油脂的降解率呈現先顯著上升后趨于平緩的趨勢。除菌株YZC2外，其余4株菌株油脂降解率培養48 h與60 h時無顯著性差異(P<0.05)，說明此時酶活力較弱，油脂降解能力低。5株菌株在培養60 h時，油脂降解率排序為：YCC2>YCC3>YZC3>YSZ11>YZC2。

圖4 培養時間對油脂降解率的影響

2.7 接菌量對油脂降解率的影響

如圖5所示，隨著接菌量的增加，油脂降解率不斷提高，當接菌量為0.20%時，5株菌株對油脂的降解率均達到最高，YZC3、YCC3、YCC2、YSZ11、YZC2降解率范圍為14.57%～56.57%。當繼續加大接種量時，油脂的降解率開始下降。

圖5 接菌量對油脂降解率的影響

2.8 菌株抗氧化性分析

注：不同大寫字母(A～E)表示差異顯著(P<0.05)。圖6 5株菌株的抗氧化能力

5株菌株的抗氧化能力如圖6所示。如圖6a可見，5株菌株對DPPH自由基均具有清除能力，不同菌株對DPPH自由基清除能力存在差異，菌株YCC3對DPPH自由基清除率最高，為74.96%，其次為菌株YSZ11，DPPH自由基清除率達到66.84%，YZC3的清除率最低為25.04%，僅達到菌株YCC3清除率的33.40%。由圖6b可知，5株菌株對羥自由基均具有清除能力，清除率在19.06%～50.17%之間。其中YCC3對羥自由基清除能力最強，為50.17%，顯著高于其他菌株(P<0.05)，YZC2對羥自由基清除能力最弱，為19.06%。由圖6c可知，5株菌株均對超氧陰離子均具有清除能力，且不同菌株之間清除率存在顯著性差異(P<0.05)。YCC3對超氧陰離子自由基清除率最高，為51.79%，顯著高于其他菌株(P<0.05)。圖6d為5株菌株的總還原力測定。可以看出5株菌株均具有還原性，不同菌株總還原力有顯著性差異。總還原力大小依次是YCC3>YZC3>YZC2>YSZ11>YCC2。綜合發現5株菌株均具有抗氧化性，且不同菌株抗氧化能力有所差異。總體而言，菌株YCC3的抗氧化能力最強，菌株YSZ11和YCC2的抗氧化能力次之。

3 討論

脂肪酶對于發酵肉制品的營養價值和風味的形成具有十分重要的作用，在發酵過程中不僅對游離脂肪酸的釋放起主導作用，而且可以在短時間內積累大量的風味前體物質，加速發酵肉制品的成熟。發酵肉制品中脂肪酶的來源有兩個途徑：肉組織中的內源性脂肪酶和在發酵過程中微生物分泌的脂肪酶。國內外許多研究人員研究了不同源菌株對發酵肉制品脂質分解的影響，發現葡萄球菌、乳酸菌、微球菌均具有較強的脂質降解能力。Kenneally等[21]報道木糖葡萄球可以促進發酵香腸中游離脂肪酸的釋放，提供更加豐富的風味前體物質。Lorenzo等[22]采用商業發酵劑制作發酵香腸，發現添加發酵劑(清酒乳桿菌和木糖葡萄球菌)香腸中脂肪酸含量顯著高于對照組(P<0.05)。

菌株是否具有脂解能力與其是否含有編碼脂肪酶的基因緊密相關。根據NCBI官網查詢，葡萄球菌和巨球菌編碼脂肪酶的相關基因為FJ979867.1、FJ979868.1、AY551101.1，本實驗5株菌株中均發現了這3種基因，這也是菌株具有脂解能力的原因所在。編碼基因不同，則生成的脂肪酶作用機制不同。如華根霉中基因pro27RCL編碼的脂肪酶對C6-C8中鏈脂肪酸具有分解作用，而基因mRCL編碼的脂肪酶則分解短鏈脂肪酸[23]。此外，有的菌株雖含有相同的編碼基因，但表達量也存在差異。張開屏等[20]對6株具有產脂肪酶性能的乳酸菌進行研究，發現6株菌株中均具有編碼脂肪酶的基因Lip0069、Lip0893，但不同菌株表達量存在顯著差異(P<0.05)，這也是降脂能力存在差異的原因所在。

不僅編碼脂肪酶的基因表達量決定菌株的脂質降解能力，培養條件(pH、溫度、時間、接菌量)也對菌株的降脂能力有重要影響。肉制品在發酵過程中利用微生物分解碳水化合物，產生大量乳酸[24]，導致肉中pH降低，因此，菌株和所產脂肪酶的耐酸性需引起重視。本實驗的5株菌株在pH為7時酶活性均較高，但隨著pH的下降，酶活性也隨之下降，只有菌株YCC2表現出較強的耐酸性。Kamarudin等[25]研究報道，表皮葡萄球菌分泌的脂肪酶在中性條件時表現出較高的酶活，隨著pH的降低，其酶活也顯著降低。劉元利等[26]的研究也表明pH為7時沙雷氏菌脂肪酶活性最高。培養溫度也對發酵菌株的降脂能力有重要影響。本實驗中的5株菌株均在32～37 ℃時油脂降解處于一個較高水平，李曉楠等[27]報道35 ℃是脂肪酶活力較高的溫度，趙興秀等[28]則研究發現所分離純化的菌株在30 ℃培養時具有最高的酶活力。培養時間和接菌量也顯著影響脂肪酶活性，本實驗中油脂降解率在48 h與60 h無顯著變化，原因可能是培養48 h時，脂肪酶活性已達到最高水平，再增加培養時間反而會使酶活力降低。鄧永平等[29]研究報道顯示酶活力在在72 h時最高，延長至96 h呈下降趨勢。接菌量過高油脂降解率也呈下降趨勢，其原因可能是過高的接種量，使培養基營養物質提前耗盡，并且培養基中的氧氣含量不足，菌株提前進入衰亡期，不利于菌株的產酶[30]；也可能是接種量過高時，菌株產酸速度加快，較低的pH抑制了脂肪酶的活力。

肉制品發酵過程中伴隨著脂質的水解也會發生脂質的氧化反應。適度的脂質氧化，有助于發酵肉制品風味的形成。然而，脂質的過度氧化會降低產品品質。因此，具有抗氧化性也是篩選發酵菌株的一個重要指標。菌株的抗氧化能力來自于兩個方面：其一為菌株本身的抗氧化性，其二為菌株的代謝產物具有抗氧化性。目前對乳酸菌的抗氧化性進行了較多研究，Chen等[31]和Ren等[32]的研究表明乳酸菌上清發酵液具有抗氧化性，推斷乳酸菌的抗氧化性主要由代謝產物產生。Monica等[33]也報道乳酸菌株在發酵過程中可以產生過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶，這些抗氧化酶可將過氧化氫物分解為水，從而體現其抗氧化性[34]。此外，有研究表明利用葡萄球菌、微球菌作為發酵劑生產發酵肉制品時，脂質氧化程度顯著低于不接種的空白組[35，36]。但是對葡萄球菌、微球菌等發酵菌株抗氧化性機制的研究較少。本實驗通過體外抗氧化性指標測定，發現菌株的抗氧化性來源于具有較強的DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力和具有較高的總還原力，從機制上解釋了菌株抗氧化性高的原因。

4 結論

利用中性紅油脂平板和三丁酸甘油酯平板從12株菌株中篩選出5株具有產脂肪酶的能力，分別為2株木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)YSZ11和YCC3、1株腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)YCC2、和2株巨球菌(Macrococcuscaseolyticus)YZC2、YZC3。對菌株編碼脂肪酶的基因進行了檢測，發現不同菌株編碼脂肪酶的基因不同，且表達量也存在顯著差異。5株菌株均在培養溫度為32～37 ℃，接種量為0.2%，培養48～60 h時具有較高的脂質降解率。通過對發酵上清液DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率和總還原力的測定表明5株菌株均具有抗氧化性。綜合考察，5株菌株中腐生葡萄球菌YCC2和木糖葡萄球菌YCC3油脂降解能力和抗氧化性較為突出，可作為備選菌株應用于發酵香腸生產中，以促進發酵香腸中脂質分解并抑制脂質的過度氧化。