薯蕷皂苷對人結腸癌細胞凋亡的作用及機制研究

管君，荀敬，王波濤，張琦，王西墨

（1.天津醫科大學研究生院，天津 300070；2.天津市南開醫院，天津市急腹癥器官損傷與中西醫修復重點實驗室，天津 300100）

結腸癌是消化道系統常見的惡性腫瘤，研究表明在中國結腸癌的發病率位于癌癥第2 位，死亡率位于腫瘤疾病前5 位[1]，且發病率呈現上升趨勢[2]。相較于手術、放化療等治療結腸癌的傳統手段[3]，草藥類化合物具有減低創傷、降低不良反應等優勢，有望成為安全有效治療結腸癌的新方法[4]。

薯蕷為薯蕷科植物薯蕷或參薯的根，性平微澀[5]，在中醫學上歸脾、肺、腎經，具有祛痰、消食利水、舒筋活血、截瘧等功效[6]。薯蕷皂苷（Dioscin）來源于薯蕷[7]，是一種天然甾體皂苷類化合物，也是現臨床常用的六味地黃丸、地奧心血康膠囊等中藥的有效成分[8]。現代藥理學研究顯示，Dioscin 對多種疾病有預防及治療作用，如抗腫瘤、抗真菌病毒、抗炎等[9]。近年來的研究顯示，Dioscin 可對結腸癌[10]、前列腺癌[11]及肝癌[12]等多種腫瘤細胞發揮抑制細胞增殖并誘導其凋亡的作用。在結腸癌中，已有蛋白組學研究發現Disocin 可能通過氧化應激途徑導致結腸癌細胞的凋亡[13]，但未進一步探討其氧化應激機制及其相關的信號通路。本文以HCT-116 細胞及RKO 細胞為研究對象，探討Dioscin 激活氧化應激機制的信號通路，為其應用于結腸癌臨床治療進一步提供了理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 Dioscin 購自美國Selleck Chemicals 公司（質量分數≥99%，批號S2379）；DMEM 培養基、胰蛋白酶、滅活胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、RIPA 裂解液、PVDF 膜和化學發光試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；抗體β-actin、Bcl-2、Nrf2、Caspase-9 以及cleaved Caspase-9（英國Abcam 公司）；抗體Akt 和p-Akt（美國Cell Signaling Technology 公司）；二甲基亞砜（DMSO）、青霉素/鏈霉素雙抗、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒、DNA 含量檢測試劑盒、ROS 檢測試劑盒、DAPI 染色劑及超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；CCK-8 檢測試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）；熒光探針MitoSOX Red（上海懋康生物科技有限公司）。

1.2 儀器 超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；二級生物安全柜（蘇州市金凈凈化科技有限公司）；CO2恒溫細胞培養箱（立康生物醫療科技控股有限公司）；酶標儀（上海科華實驗系統有限公司）；全自動多功能化學發光成像儀（上海天能科技有限公司）；流式細胞儀（美國ACEA 公司）；倒置熒光相差顯微鏡（德國Leica 公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（日本Hirayama 公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 人結腸癌細胞系HCT-116 細胞、RKO 細胞（購自中國科學院細胞研究所）在含有10% FBS 和1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM 培養液中培養，放置在37℃、飽和濕度、5%CO2的培養箱中，每2～3 d 換液，用胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.2 CCK-8 實驗 將生長狀態良好，處于對數生長期的HCT-116 細胞、RKO 細胞以5×104/mL 的細胞密度、100 μL/孔接種于96 孔板中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。將HCT-116 細胞培養12 h待貼壁后開始加藥處理，分別設置空白組、對照組（DMSO 溶劑）和Dioscin 組（2、4、6、8、10 μmol/L），每組設置3 個復孔，分別培養24、48 h。將RKO 細胞培養12 h 待貼壁后開始加藥處理，分別設置空白組、對照組（DMSO 溶劑）和Dioscin 組（5、10、15、20、25 μmol/L），每組設置3 個復孔，分別培養24、48 h。測量前，每孔加入10 μL CCK-8 工作液，震蕩混勻后繼續正常培養2 h，用酶標儀在450 nm 波長處測定吸光度（A）值，計算細胞存活率及半數抑制濃度（IC50）值。

細胞存活率=（藥物組A 值－空白組A 值）/（對照組A 值－空白組A 值）

1.3.3 試劑盒檢測 細胞LDH 釋放量和SOD 活性嚴格按照試劑盒說明書操作步驟執行，分別檢測LDH 和SOD 的表達水平。

1.3.4 流式細胞術（Annexin V-FITC/PI 雙染法）檢測細胞凋亡 取對數生長期的HCT-116 細胞、RKO細胞，用完全培養液重懸后，以5×105個/孔的細胞數目接種于6 孔板中培養。待細胞貼壁后，HCT-116藥物組加入Dioscin（4、6 μmol/L）處理，RKO 藥物組加入Dioscin（5、10 μmol/L）處理，并各自設置對照組。繼續培養24 h 后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，離心收集細胞后用預冷的PBS 清洗。實驗過程按照Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒操作，各組加入5 μL Annexin V-FITC 輕搖混勻，之后加入10 μL PI 染色液混勻，室溫避光孵育20 min后，用流式細胞儀進行檢測分析。細胞凋亡率＝早期細胞凋亡率＋晚期細胞凋亡率

1.3.5 流式細胞術檢測細胞DNA 含量 細胞培養及處理方法同“1.3.4”項，離心后收集的細胞用預冷的PBS 沖洗2 次，制備成單細胞懸液后去除上清，在細胞中加入70%預冷乙醇500 μL，固定2 h 過夜，4℃保存，染色前用PBS 洗去固定液。在細胞沉淀中加100 μL RNase A 溶液，重懸細胞后以37℃水浴30 min，再加入400 μL PI 染色液混勻，4℃避光孵育30 min，之后用流式細胞儀進行檢測分析。

1.3.6 流式細胞術檢測細胞內ROS 表達水平 取對數生長期、生長狀態良好的HCT-116 細胞、RKO細胞，以5×105/孔的細胞數目接種于6 孔板中，在37℃、5%CO2的培養箱中孵育。待細胞貼壁之后，HCT-116 細胞各加入4、6 μmol/L 的Dioscin，RKO 細胞各加入5、10 μmol/L 的Dioscin，另各自設立對照組，收集細胞棄去上清后用預冷的PBS 洗滌2次，之后加入10 μmol/L的DCFH-DA 溶液，在室溫中避光孵育10 min，孵育完成后用PBS 洗滌細胞2次，再用500 μL PBS 重懸細胞，用流式細胞儀檢測細胞內ROS 表達水平。

1.3.7 熒光染色法觀察細胞超氧化物的表達情況 取生長狀態良好的HCT-116 細胞，以3×105/孔的細胞濃度接種于6 孔板中，每孔2 mL 的細胞懸液。待細胞貼壁后，藥物組加入Dioscin（4、6 μmol/L）處理細胞，對照組加入相同體積的DMSO 溶劑。取生長狀態良好的RKO 細胞，以5×105/孔的細胞濃度接種于6 孔板中，每孔2 mL 的細胞懸液。待細胞貼壁后，藥物組加入Dioscin（5、10 μmol/L）處理細胞，另設對照組。在培養箱中繼續培養24 h 后收集細胞并用預冷的PBS 緩沖液洗滌細胞2 次，按照熒光探針MitoSOX Red 及DAPI 染色劑說明書處理待測細胞，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.8 Western 印跡法檢測細胞相關蛋白的表達 取處于對數生長期生長狀態良好的HCT-116 細胞、RKO 細胞以5×105個/孔細胞密度接種于6 孔板中，每孔2 mL 的細胞懸液。待細胞貼壁后，HCT-116 細胞加入Dioscin（4、6 μmol/L）處理，RKO 細胞加入Dioscin（5、10 μmol/L）處理，對照組細胞加入等體積的DMSO 溶劑。置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h 后棄去培養液，用遇冷的PBS 緩沖液沖洗2 遍后收集各組細胞，分別加入200 μL 的RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定，蛋白樣品進行SDS-PAGE 凝膠電泳，之后濕轉到PVDF 膜上，用含有5%脫脂奶粉的TBST 溶液封閉1 h，分別加入β-actin、Bcl-2、Nrf2、AKT、p-Akt、Caspase-9 以及cleaved Caspase-9 蛋白抗體（稀釋比例為1:1 000），一抗4℃孵育過夜，室溫下用TBST 溶液洗膜3 次，每次10 min。然后分別加入辣根過氧化物酶標記的二抗（稀釋比例為1:5 000），室溫孵育1 h，室溫下用TBST 溶液洗膜3次，每次10 min。采用化學發光法檢測，結果在化學發光成像儀上顯影，使用Image J 軟件對各蛋白條帶的灰度值進行半定量分析，計算目的蛋白和內參蛋白的灰度比值。

1.4 統計學處理 除特殊說明外，所有實驗均進行3 次及以上的生物學重復測試。使用GraphPad Prism 7.0 軟件繪圖并進行統計分析，結果均用表示，組間差異比較應用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行統計學分析，P＜0.05 表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Dioscin 對結腸癌細胞生長的影響 CCK-8 實驗結果顯示，以不同濃度Dioscin 分別作用于HCT-116 細胞、RKO 細胞，分別檢測24 h 和48 h 的細胞存活率。HCT-116 細胞結果顯示，經過Dioscin 處理24 h 后，與對照組相比，2、4、6、8、10 μmol/L 組的細胞存活率降低（均P＜0.05）。經過Dioscin 處理48 h后，與對照組相比，2、4、6、8、10 μmol/L 組的細胞存活率降低（均P＜0.05）；RKO 細胞結果顯示，經過Dioscin 處理24 h 后，與對照組相比，5、10、15、20、25 μmol/L 組的細胞存活率降低（均P＜0.001）。經過Dioscin 處理48 h 后，與對照組相比，5、10、15、20、25 μmol/L 組的細胞存活率降低（均P＜0.001）。從時間梯度上，48 h 相較于24 h 的25 μmol/L組的細胞存活率降低（P＜0.05），結果見圖1。此外，Dioscin 作用HCT-116 細胞24 h 和48 h 的半數抑制濃度（IC50）值分別為6.15 μmol/L 和5.89 μmol/L，RKO 細胞24 h 和48 h 的半數抑制濃度（IC50）值分別為16.15 μmol/L 和13.77 μmol/L。

圖1 Disocin 對結腸癌細胞存活率的影響Fig 1 Effect of Dioscin on cell viability rates of colon cancer cell

2.2 Dioscin 對結腸癌細胞LDH 釋放量的影響 HCT-116 細胞結果顯示，經過Dioscin 處理24 h 后，與對照組相比，2、4、6、8、10 μmol/L 組細胞的LDH 釋放量升高（均P＜0.05）。經過Dioscin 處理48 h 后，與對照組相比，2、4、6、8、10 μmol/L 組細胞的LDH 釋放量升高（均P＜0.001）。由圖2 可看出，從時間梯度上，48 h 相較于24 h 的10 μmol/L 組細胞的LDH釋放量升高（P＜0.001）；RKO 細胞結果顯示，經過Dioscin 處理24 h 后，與對照組相比，5、10、15、20、25 μmol/L 組細胞的LDH 釋放量升高（均P＜0.001）。經過Dioscin 處理48 h 后，與對照組相比，10、15、20、25μmol/L組細胞的LDH 釋放量升高（均P＜0.01）。從時間梯度上，48 h 相較于24 h 的25 μmol/L組細胞的LDH 釋放量升高（P＜0.001）。

圖2 Dioscin 對結腸癌細胞LDH 釋放量的影響Fig 2 Effect of Dioscin on LDH release of colon cancer cells

2.3 Dioscin 對結腸癌細胞DNA 含量的影響 Dioscin作用細胞24 h 后，HCT-116 細胞和RKO 細胞的DNA 含量則隨Dioscin 濃度增加明顯上升，且差異顯著（P＜0.05，P＜0.001）（圖3）。

圖3 Dioscin 對結腸癌細胞DNA 含量的影響Fig 3 Effect of Dioscin on DNA content of colon cancer cells

2.4 Dioscin 對結腸癌細胞凋亡的影響 HCT-116細胞的結果顯示，與對照組相比，4、6 μmol/L 組細胞總凋亡率增加（均P＜0.001），且6 μmol/L 組相較于4 μmol/L 組總凋亡率也呈上升趨勢（P＜0.05）；RKO 細胞的結果顯示，與對照組相比，5、10 μmol/L組細胞總凋亡率增加（P＜0.01，P＜0.001），且10 μmol/L組相較于5 μmol/L 組總凋亡率具有統計學差異（P＜0.01）（圖4）。

圖4 Dioscin 對結腸癌細胞凋亡的影響Fig 4 Effect of Dioscin on apoptosis of colon cancer cells

2.5 Dioscin 對結腸癌細胞凋亡相關蛋白表達的影響 HCT-116 細胞的Western 印跡結果顯示，與對照組相比，4、6 μmol/L 組細胞Bcl-2 蛋白表達水平下調（均P＜0.001），cleaved Caspase-9 蛋白表達水平上調（均P＜0.001）；RKO 細胞的Western 印跡結果顯示，與對照組相比，10 μmol/L Dioscin 組Bcl-2 蛋白表達下調（P＜0.001），Dioscin 組cleaved Caspase-9蛋白表達水平均上調（P＜0.01，P＜0.001）（圖5）。

2.6 Dioscin 通過氧化應激機制導致結腸癌細胞凋亡 用Dioscin 處理HCT-116、RKO 細胞24 h 后，使用熒光探針法處理后以流式細胞術檢測細胞內ROS 水平變化情況。結果顯示，經4、6 μmol/L Dioscin 處理后，HCT-116 細胞內ROS 水平較對照組上調（P＜0.05，P＜0.001）；經5、10 μmol/L Dioscin處理后，RKO 細胞的ROS 水平較對照組上調（均P＜0.001），且HCT-116 及RKO 細胞的ROS 表達情況均呈現濃度依賴性（圖6）。

通過熒光探針法檢測線粒體超氧化物的表達情況，HCT-116 細胞結果顯示，與對照組相比，4、6 μmol/L 組細胞的超氧化物含量增多（均P＜0.001），且隨著Dioscin 濃度增加，超氧化物含量也逐漸上調（P＜0.001）；RKO 細胞結果顯示，經5、10 μmol/L Dioscin 處理后，細胞的超氧化物含量較對照組增多（均P＜0.001），見圖7。

圖7 Dioscin 對結腸癌細胞超氧化物含量的影響（200×）Fig 7 Effect of Dioscin on superoxide content of colon cancer（200×）

從圖8 可以看出，經4、6 μmol/L Dioscin 處理后，HCT-116 細胞的SOD 活性較對照組降低（P＜0.05，P＜0.001）；經5、10 μmol/L Dioscin 處理后，RKO細胞的SOD 活性較對照組降低（均P＜0.001），且HCT-116 及RKO 細胞的SOD 的表達情況均呈現濃度依賴性。

圖8 Dioscin 對結腸癌細胞SOD 活性的影響Fig 8 Effect of Dioscin on SOD activity of colon cancer cells

2.7 Dioscin 對結腸癌細胞Nrf2 信號通路相關蛋白表達的影響 Western 印跡法檢測相關蛋白表達結果顯示，與對照組相比，HCT-116、RKO 藥物組細胞隨著Dioscin 濃度增加，磷酸化Akt（P＜0.05，P＜0.001）和Nrf2（均P＜0.001）表達水平逐漸下調（圖9）。

圖9 Dioscin 對結腸癌細胞Nrf2 信號通路相關蛋白表達的影響Fig 9 Effect of Dioscin on Nrf2 signaling pathway-related protein expression of colon cancer cells

3 討論

結腸癌是常見的惡性實體腫瘤，其不良預后嚴重影響了人類的身心健康。Dioscin 是一種傳統中草藥提取的天然糖苷，廣泛存在于多種草本植物中[14]，已有研究表明其具有抗癌活性[15]。基于腫瘤發生、發展的復雜性，本實驗以人結腸癌HCT-116、RKO 細胞為研究對象，探討Dioscin 激活氧化應激，誘導細胞凋亡的機制。

細胞凋亡是細胞受基因調控的一種程序性死亡形式，在正常情況下機體通過凋亡來清除受損或病變細胞來維護機體健康。細胞凋亡主要有內源性和外源性兩種途徑，內源性途徑主要在線粒體水平由DNA 損傷和代謝應激啟動凋亡[16]。在線粒體途徑中調控細胞凋亡的主要因子是Bcl-2 抗凋亡蛋白[17]，Bcl-2 表達改變會影響線粒體膜通透性，從而使細胞色素C 釋放激活下游Caspase 蛋白，最終導致細胞凋亡[18]。有研究表明Dioscin 可通過上調Caspase 3、下調Bcl-2 的表達來抑制肝癌細胞活性[19]，也有研究表明Dioscin 可以激活線粒體信號途徑導致皮膚癌細胞凋亡[20]。對于結腸腫瘤，本研究結果表明Dioscin 可通過線粒體途徑對腫瘤細胞產生毒性作用，誘導細胞凋亡。Western 印跡結果同樣表明加藥后抗凋亡蛋白Bcl-2 表達下調，促凋亡蛋白cleaved Caspase-9 表達上調。

在許多病理狀態下，發生活性氧和抗氧化系統失衡即為氧化應激。細胞ROS 的產生主要在線粒體內，若ROS 產生過多致使內環境失衡，細胞就會發生氧化應激，造成細胞凋亡[21]。一般情況下，機體中存在的SOD 等抗氧化系統可通過清除氧自由基對抗氧化應激，清除線粒體氧化還原過程中產生的ROS[22]。在炎癥方面，有研究發現Dioscin 通過改善氧化應激、細胞凋亡來減輕二甲基亞硝胺（DMN）誘導的急性肝損傷[23]；在腫瘤方面，已有文章闡明Dioscin 可促進ROS 介導的p38-MAPK/HSP27 信號途徑來誘導肺鱗癌細胞的凋亡[24]。本研究表明了Dioscin 可通過ROS 介導的氧化應激來激活線粒體途徑的結腸癌細胞凋亡。

PI3K/Akt 是氧化應激的主要途徑之一，跟細胞凋亡相關的PI3K/Akt 信號轉導的下游靶點為Nrf2[25]。Nrf2 是一個監控機體氧化應激的重要轉錄因子，在正常生理條件下，Nrf2 通過與Keap1 結合來維持穩定狀態，但在蛋白激酶的作用下，Nrf2 可以和Keap1解離轉入細胞核內，并識別ARE 序列以激活后續的SOD 等多種抗氧化蛋白酶[26]，進而消除有害物質使ROS 失活。Western 印跡結果表明，加藥后抗氧化蛋白Nrf2、p-Akt 表達下調，說明Dioscin 可能通過PI3K/Akt/Nrf2 信號通路抑制SOD 表達，使細胞超氧化物含量及ROS 升高，進而激活后續的線粒體相關凋亡途徑。

針對膽囊癌的研究證實Dioscin 可通過ROS介導的PI3K/Akt 信號轉導誘導膽囊癌細胞凋亡[27]。對于Dioscin 有關結腸癌的相關研究中，有文章表明Dioscin 可通過P38 和JNK 途徑抑制腫瘤生長[10]。本研究提示Dioscin 可能通過抑制PI3K/Akt/Nrf2信號通路來介導ROS 蓄積從而激活下游的線粒體途徑誘導細胞凋亡。目前還有研究表明Dioscin 還可通過鐵死亡[28]、細胞焦亡[29]等方式來延緩其他疾病進展，故而對于Dioscin 治療結腸癌的更多機制研究，還有待進一步發現。

綜上所述，Dioscin 可能通過PI3K/Akt/Nrf2 信號通路介導氧化應激發揮作用，抑制人結腸癌HCT-116 細胞及RKO 細胞生長并誘導其凋亡，進一步證明了Dioscin 的抗結腸癌作用，為其對結腸癌的臨床應用提供了理論和實驗依據。