CA9基因在舌鱗狀細胞癌組織中的表達及其預后價值分析

趙格 黎昌學 郭超

舌鱗狀細胞癌(tongue squamous squamous cell cellcarcinomas carcinomas，TSCC)是口腔鱗狀細胞癌中最常見的子型，近年來發病率有所上升[1-2]。與口腔其他部位的癌癥相比，舌鱗癌進展迅速，轉移率高，預后差[3]。TNM分期被認為是舌鱗癌的關鍵預后因素[4]，然而由于高度異質性，TNM分期不能描述同一分期患者的個體風險。因此，迫切需要新的基因標志物來區分高危患者，以協助指導個體化治療，延長患者生存時間。

腫瘤缺氧微環境不僅在腫瘤的增殖分化中起著關鍵作用，還影響了手術和放化療的療效反應[5-6]。碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9，CA9)是缺氧誘導作用最強的基因之一，可調節細胞增殖和細胞內外酸堿平衡，在肺、乳腺、結直腸、膀胱、子宮和頭頸部等惡性腫瘤中高表達[7]。Potter等[8]研究表明CA9在多種腫瘤細胞中的異常表達與不良預后有關，可作為侵襲性惡性行為的標志，預測疾病進展。

本研究通過癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)分析CA9在舌鱗癌中的表達和對患者預后的影響，并通過基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)探索CA9可能參與的腫瘤相關信號通路，為明確CA9在舌鱗癌中發生發展機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 數據來源

2020 年3 月26 日于TCGA官網下載舌鱗狀細胞癌RNA-Seq表達數據及其臨床信息。得到147 例舌鱗癌組織樣本、15 例癌旁組織樣本和156 例舌鱗癌患者信息。將CA9表達信息與臨床信息合并，用于后續分析。

1.2 GSEA富集分析

使用GSEA將CA9按照表達高低進行排序，檢驗KEGG通路基因集是否在這個排序表的頂端或者底端富集。設置隨機組合次數為1 000 次，計算標準化富集系數。篩選出符合FDR≤0.25，P≤0.05的結果作為顯著富集通路。

1.3 統計學方法

統計分析通過R語言3.6.2版本及其附屬包來實現。采用Wilcoxon秩和檢驗分析舌鱗癌組織與癌旁組織CA9的表達差異。采用Wilcoxon、Kruskal-Wallis秩和檢驗和邏輯回歸分析分析CA9與臨床病理特征的關系。Kaplan-Meier生存分析采用Log-rank檢驗法。CA9表達和其他臨床特征(年齡Age、性別Gender、病理分級Grade、臨床分期Stage、區域淋巴結轉移N、原發腫瘤范圍T)對生存率影響采用單因素、多因素Cox回歸分析。

2 結 果

2.1 CA9在舌鱗癌及癌旁組織中的表達差異

舌鱗癌組織中CA9表達量高于癌旁組織，差異具有統計學意義(P<0.001)(圖1A)。而且15 例舌鱗癌組織中CA9表達水平也明顯高于其配對癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.001)(圖1B)。

圖1 CA9在舌鱗癌和癌旁組織中的表達

2.2 舌鱗癌組織中CA9表達水平與臨床病理特征關系

Wilcoxon、Kruskal-Wallis秩和檢驗表明CA9表達水平與腫瘤大小(T)相關(P=0.007)，但與年齡、性別、病理分級、臨床分級、淋巴轉移結情況不相關(P>0.05)(表1)。邏輯回歸分析顯示T2、T3、T4期舌鱗癌CA9表達量均高于T1期，OR值分別為3.76、8.50、5.10(表2)。

表1 CA9表達與臨床病理相關性(秩和檢驗)

表2 CA9表達與臨床病理特征相關性(邏輯回歸)

2.3 CA9的表達水平與舌鱗癌患者預后關系

以CA9表達量中位值為依據將腫瘤組樣本劃分為高低表達兩組，Kaplan-Meier生存分析顯示CA9高表達組死亡率比低表達組高(P=0.001)(圖2)。患者1 年生存率ROC曲線的AUC值為0.747(圖3)。

圖2 TCGA數據庫中CA9表達水平與舌鱗癌患者預后的生存曲線

圖3 舌鱗癌患者1年生存率ROC曲線的AUC值

單因素Cox回歸分析顯示，CA9表達量與患者的總生存率明顯相關(P<0.001)；多因素Cox回歸分析表明在考慮其他臨床因素時，CA9是影響舌鱗癌患者總生存率的獨立預后因素(P<0.001)(表3)。

表3 舌鱗癌患者臨床病理特征對預后影響的單因素及多因素分析

2.4 CA9功能富集分析

為了解CA9表達對舌鱗癌的影響，本研究對CA9高表達組與低表達組數據集進行了GSEA富集分析。CA9高表達富集在糖酵解糖異生、磷酸戊糖途徑、氨基糖和核苷酸糖代謝、不飽和脂肪酸生物合成途徑、丙酮酸代謝、DNA復制、核苷酸切除修復、同源重組、錯配修復、堿基切除修復、剪切體、細胞周期、膀胱癌等相關通路(表4)。CA9表達與上述通路中的基因表達成正相關。

表4 GSEA富集分析CA9相關信號通路

3 討 論

舌鱗狀細胞癌惡性程度高、預后差。被認為具有良好預后的Ⅰ、Ⅱ期舌鱗癌仍有較高的死亡率[9]。因此，迫切需要預測舌鱗癌預后風險的生物標志物，這有助于個性化治療的實現。缺氧是腫瘤重要的微環境，通過誘發酸性內環境、重塑細胞外基質、觸發腫瘤微血管形成、誘導上皮間質轉化、促進腫瘤免疫逃避腫瘤適應、維持腫瘤干細胞存在等機制促進腫瘤增殖。靶向缺氧關鍵基因可能成為新的有效的腫瘤治療策略。CA9在多種腫瘤中差異表達，是腫瘤缺氧的內源性標志物，受缺氧誘導因子-1(HIF-1)的轉錄調控但比HIF-1更穩定，具備作為穩定預測因子的條件[10-12]。

每種腫瘤都有獨特的突變，呈現不同的臨床表現并與特定的風險因素相關[5]。盡管已有部分研究證明CA9在頭頸部及口腔鱗癌中差異表達[13]，但舌鱗癌中CA9表達情況與預后關系鮮有報導。本研究通過TCGA數據分析發現，與癌旁組織相比CA9在舌鱗癌組織中高表達。CA9的表達與T分期相關，T2-T4期患者中CA9的表達均高于T1期，提示舌鱗癌中CA9可能發揮促腫瘤細胞的作用。Kaplan-Meier生存分析顯示CA9高表達組比低表達組死亡率高，且患者1年生存率ROC曲線AUC值為0.747，表明該基因在預測舌鱗癌患者生存預后風險方面具有較好預測能力。單因素和多因素Cox回歸分析顯示CA9是影響舌鱗癌患者總生存率的獨立預后因素，有力證明了其在舌鱗癌中較高的預后價值。

為了解CA9基因表達對腫瘤發生發展的影響，我們通過GSEA富集分析得到CA9高表達組富集集中在糖酵解與糖異生、磷酸戊糖途徑、氨基糖和核苷酸糖代謝、不飽和脂肪酸等生物合成途徑。文獻表明缺氧狀態下腫瘤細胞的存活依賴于糖酵解活性的增加[14]。糖酵解為生物合成(如核苷酸、氨基酸和脂質)提供底物，促進腫瘤細胞增殖[15]。Chafe等[16]發現靶向CA9可降低腫瘤細胞的糖酵解代謝和細胞外酸化，使免疫細胞殺傷增強。證明CA9是參與糖酵解促進腫瘤增殖的重要基因。其次，CA9是穩定胞外酸性環境的重要蛋白，CA9維持的細胞外酸性微環境可中和缺氧條件下谷氨酰胺代謝產生的有毒廢物氨，進而為線粒體TCA循環和戊糖磷酸途徑提供支持，為合成腫瘤細胞所需的氨基酸、核苷酸、脂肪酸、氨基己糖等提供原料[17]。以上與GSEA富集結果一致，表明CA9在舌鱗癌中可通過增強糖酵解和維持谷氨酰胺代謝環境促進腫瘤生長。此外，GSEA富集顯示CA9高表達與細胞周期和DNA損傷等通路密切相關，提示CA9或可直接促進舌鱗癌細胞增殖發揮促癌作用。

本研究僅對CA9基因表達量進行了研究探討，后續還需實驗驗證CA9蛋白在舌鱗癌組織中的表達。綜上所述，本研究通過TCGA數據庫挖掘明確CA9表達是影響舌鱗癌預后的獨立風險因素，通過GSEA富集分析預測了CA9影響預后的機制。為舌鱗癌預后判斷提供了候選生物標志物，并為探討CA9參與舌鱗癌進展的分子機制研究提供了理論基礎。