一種以羊肝為原料的寵物誘食劑發酵工藝研究

孫 蓓，金 杰，劉曉娟，肖欣欣，李 晴，朱中原，王利斌，王龍剛，王維婷，*

（1.江蘇省徐州醫藥高等職業學校，江蘇徐州 221116；2.山東省農業科學院農產品加工與營養研究所/山東省農產品精深加工技術重點實驗室/農業農村部新食品資源加工重點實驗室，山東濟南 250100；3.江蘇聯益生物科技有限公司，江蘇淮安 211700）

近年來，隨著經濟的持續發展，人們生活節奏不斷加快，家庭及人際關系日益疏遠，寵物在家庭生活中的地位越來越高，成為許多人的精神寄托。寵物行業因此也得到迅速擴張，據互聯網寵物行業各細分市場收入統計，寵物食品收入占比39.3%，是寵物行業的主要部分（吳孝杰等，2019）。

目前按照形態寵物食品可分為干型（干物質80%～90%）、濕型（干物質15%～40%）、半干型（干物質50%）3種類型。國內半干型寵物食品多數以屠宰下腳料為基礎原料，調整pH后經熱處理制成，與國外發酵類半干型產品相比，技術含量低，競爭力差。張建斌等（2015）利用鯰魚魚骨為主要原料，雞肝為輔料，采用酶解、美拉德反應和發酵等方式，獲得了較好的發酵效果。雖然國內目前的肉制品發酵已被廣泛應用并帶來各種優點（吳麗紅和賀稚非，2005），但與之類似可以用于指導企業生產的關于發酵類寵物食品的產品和技術方面的研發鮮有報道，因此，有必要開展相關研究，以提升行業及企業競爭力。

羊肝含有豐富的維生素，如維生素A、B族維生素，是一種營養豐富的動物源性食品原料（姚碧霞等，2008；楊月欣，2005；FrΦslie，1983）。與其他動物肝臟相較，羊肝中的鐵、銅和γ-亞麻酸含量更高（Bah，2015）。

本團隊前期經選育、培養得到了一種以肝臟為底物的可調節寵物腸道菌群的復合發酵菌種，在本研究中以冷凍羊肝臟為基礎原料，對其發酵工藝進行優化，希望能為寵物發酵系列產品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 冷凍羊肝：購自濟南市惠民廣場馬家牛羊肉店；復合菌種：乳酸菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、酵母菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌、土豆淀粉（食品級）：甘肅正陽現代農業附有有限公司；乳糖（食品級）：河南春祥化工產品有限公司；白糖（食品級）：河北省邢臺市隆堯縣東方食品城；雞油（食品）：山東頂嘉油脂有限公司。

1.2 儀器與設備 pH計（FE28）：梅特勒-托利多儀器有限公司；電子分析天平（BSA124S-CW）：斯多利斯科學儀器（北京）有限公司；可調高速勻漿機（FSH-2）：常州市偉嘉儀器制造有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DH6-92435-III）：上海新苗實業有限公司；色差色差計（CR-400）：柯尼卡美能達（中國）投資有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 100 g羊肝泥與雞油、蔗糖乳糖混合糖粉、土豆淀粉混勻后高溫高壓滅菌處理15 min，隨后接種復合菌，37℃條件下發酵7 d。發酵完成后，測定發酵物pH、發酵損失，并對發酵產物進行氣味、色澤的感官評價，并進行綜合評分。

單因素試驗分析了雞油、混合糖粉、發酵底物濕度（土豆淀粉添加量）對發酵結果的影響，從中篩選出參數進行響應面分析，并根據結果完成驗證試驗。

糖粉總添加量為7 g，響應面分析中計算比例為乳糖：蔗糖（m：m）：1：6記為0.14，2：5記為 0.28，3.5：3.5記 為 0.5，5：2記 為 0.71，6：1記為0.85。

1.3.2 pH值的測定 準確稱取10 g樣品于燒杯中，加入100 mL氯化鉀溶液，12000 rpm勻漿60 s，把勻漿完的溶液用保鮮膜封住，靜置30 min，打開保鮮膜，充分搖勻。校準pH計后測定溶液pH，重復3次并記錄數據，分別測量發酵物發酵前后的pH。

1.3.3 發酵損失計算 發酵損失計算公式如下：

發酵損失 /%=（m1-m2）/m1×100 ；

式中：m1代表發酵前發酵物質量，g；m2代表發酵后發酵物質量。

1.3.4 發酵效果評分計算 色澤分：發酵產物顏色以褐色為主，發酵產物顏色有金褐色、褐色、棕紅色、深褐色、土色等顏色，以深褐色得分最高，土色、棕紅色次之，其次褐色、金褐色。

pH：以pH=5.0為滿分，±0.01則減1分。

氣味：以有肉香最佳，醬香其次、酸香次之，有土豆淀粉生粉味道者最差。

綜合上述評分，按照以下公式計算加權得分：

發酵產物綜合得分=色澤×0.1+氣味×0.2+pH得分×0.1+發酵損失×0.6

1.4 單因素試驗

1.4.1 濕度對發酵結果的影響 在100 g羊肝泥中添加混合糖粉7 g：乳糖：蔗糖（W：W）2：5，雞油16 g，用土豆淀粉調整肝泥濕度分別為20%、30%、40%、50%、60%，發酵后計算發酵產物的綜合得分。

1.4.2 混合糖粉的比例對發酵結果的影響 在100 g羊肝泥中分別添加不同比例混合糖分7 g：乳糖 ：蔗糖（m ：m）1：6、2：5、3.5：3.5、5：2、6：1，雞油16 g，用土豆淀粉調整肝泥濕度30%，發酵后計算發酵產物的綜合得分。

1.4.3 雞油添加量對發酵結果的影響 在100 g羊肝泥中添加混合糖粉7 g：乳糖：蔗糖（W：W）2 ：5，雞油添加量分別為 0、8、16、24、32 g，用土豆淀粉調整肝泥濕度30%，發酵后計算發酵產物的綜合得分。

1.5 響應面試驗設計 根據單因素試驗的結果，以發酵產物綜合得分為指標，設計響應面試驗，建立3因素3水平Box-Behnken中心組合實驗（Huang，2011），數據用 Design-Expert軟件統計，各因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表

2 結果與分析

寵物食品的pH適當偏酸有助于寵物形成酸性尿液，有利于抑制細菌的滋生（張松山等，2009；馮秀娟等，2008），但酸性過強會影響適口性。在本研究結合前期動物采食試驗結果及后續加工需要，選取pH=5.0為最佳發酵底物pH標準，結合發酵損失、發酵產物質構變化及氣味等指標，綜合分析了發酵底物濕度（土豆淀粉添加量）、混合糖分、雞油對發酵結果的影響。

2.1 羊肝發酵工藝單因素試驗

2.1.1 濕度對發酵結果的影響 由表2可知，發酵過程中，發酵底物中大分子量的營養物質會被分解為更易消化吸收的小分子，同時也會產生獨特的風味（曹朝輝，2016），但此過程中，有機化合物會被分解為有機酸、二氧化碳和水分，從而造成發酵損失，增加了生產成本，因此，發酵損失也是企業生產工藝篩選的一個非常重要的指標。隨著發酵底物濕度的增加，肉香味隨濕度增加而更加濃郁，但發酵損失、pH、發酵物顏色粘聚性呈先上升后下降的趨勢。濕度20%～30%時發酵綜合得分較高。

表2 濕度對發酵結果的影響

2.1.2 混合糖粉比例對發酵結果的影響 由表3可知，隨著乳糖添加量的增加，發酵損失出現了不規律的波動，說明碳源比例對發酵菌種的發酵效率有一定影響。pH總體呈先下降后上升的趨勢，顏色隨著蔗糖添加量的減少而逐漸加深，同時，發酵產物中的酸香味減輕并消失，肉香味和醬香味開始增加。在微生物發酵過程中，菌種生長的主要碳源來自各種糖，主要為蔗糖、葡萄糖、麥芽糖，乳糖等（周傳云等，2004；張弘等，1992），本試驗選取了購買方便且成本低廉的蔗糖和乳糖作為原料糖。因此，在碳源選擇上，應著重考慮其對發酵產物風味的影響，其次是發酵損失。

表3 糖粉比例對發酵結果的影響

2.1.3 雞油添加量對發酵結果的影響 由表4可知，雞油添加量對發酵產物顏色及流變學特性影響不大，但隨著雞油的添加可以減少發酵損失，并對發酵產物的風味產生明顯影響，隨著雞油添加量的增加，肉香味明顯增加，這是因為向產品中添加適量脂肪，有利于改善產品的質地、口感及色澤，而雞油成本低廉、便于購買，是一種常見的原料脂肪。

表4 雞油添加量對發酵結果的影響

2.2 響應面法優化發酵工藝

2.2.1 響應面法優化試驗結果 用Design-Expert 8.05b軟件對響應面試驗結果進行回歸分析，得到發酵產物綜合評分（Y）對自變量發酵底物濕度（A）、雞油添加量（B）、混合糖粉比例（C）的二次回歸模擬方程：

Y=63.39+0.41A+1.45B+19.60C+0.01AB+0.02AC-0.06BC-8.86E-003A2-0.04B2-16.83C2

對該回歸模擬方程進行方差分析和差異顯著性檢驗，結果見表6。

由表5可知，該模型具有顯著性（P＜0.05），模型失擬項0.8894＞0.05不顯著，模型的調整確定系數（R2adj）為0.9237，可解釋92.37%響應值的變化，相關系數（R2）為 0.9666，與 R2adj較接近，表明此模型擬合程度較好，誤差不大，故可用此模型對羊肝發酵工藝結果進行分析與預測。在總的作用因素中，除去B、AC、BC所有項均對結果有顯著影響。

表5 回歸系數模型及方差分析

2.2.2 響應面結果分析與優化 由圖1～圖3可以看出回歸方程預測4個因素對發酵產物綜合評分的影響：由圖1可知，隨著雞油添加量的增加，發酵產物綜和評分呈現先上升后下降的趨勢，發酵底物濕度與雞油添加量之間有明顯交互作用。雞油添加量及發酵底物濕度的加大在發酵過程中為發酵產物提供了更佳的風味，但會對產品色澤及凝聚性產生不利影響，影響了綜合得分，發酵濕度的增加會使發酵損失增加，雞油添加量的適當增加能對這一缺憾進行彌補。

圖1 發酵底物濕度和雞油添加量交互作用對發酵產物綜合評分的影響

由圖2可知，混合糖粉比例和底物濕度影響對綜合評分的交互作用明顯，體現在適當增加糖粉中乳糖含量能減少發酵底物濕度增加所帶來的發酵損失，同時減輕了發酵產物中酸、苦等不良風味的產生。

圖2 發酵底物濕度和混合糖粉比例交互作用對發酵產物綜合評分的影響

由圖3可知，雞油與糖粉比例對綜合評分的交互作用主要體現在對整個發酵產物色澤的改良上。雞油是風味產生的一個重要因素，但其添加量的增加降低了發酵物的色澤吸引度，而適當增加糖粉中乳糖的添加比例能起到一定的補償效果。

圖3 雞油添加量和混合糖粉比例對發酵產物綜合評分的響應面分析

2.3 最佳工藝參數確定及驗證性試驗 在本試驗選取的因素范圍內，通過Design Expert軟件回歸模型分析得出，最優的發酵工藝條件為發酵底物濕度43.09%，雞油添加量24.22 g，混合糖粉比例乳糖：蔗糖（m：m）為3.15：3.85。在該條件下模型預測發酵產物綜合評分能達到96.71分。為便于實際操作，將各因素參數確定如下：發酵底物濕度43%，雞油添加量24 g，乳糖：蔗糖（m：m）3.2：3.8。

為了驗證模型結果，用確定的參數進行了3次發酵試驗，發酵綜合得分平均為（97.01±0.23），與預測值基本一致，證明了該方程與實際情況擬合度佳，響應面分析法可以應用于羊肝泥發酵工藝參數的優化篩選。

3 結論

羊肝中含有豐富的維生素和微量元素，但因其膻味重及羊副產物綜合開發利用不足等原因，造成了大量的資源浪費，本研究開發了一種羊肝泥發酵工藝，通過響應面法優化的最佳發酵工藝參數為：每百克羊肝泥用土豆淀粉調整發酵底物濕度43%，添加雞油24 g，同時將7 g混合糖粉比例控制為乳糖：蔗糖（m：m）3.2：3.8。該參數下發酵羊肝泥產品的綜合評分可達到97分，能較好的控制發酵損失，并在產品色澤和風味上起到很好的誘食效果。