去甲腎上腺素轉運體和多巴胺轉運體在甲基苯丙胺成癮致大鼠心肌損傷中的作用及機制

趙夏浦，姚志軍，涂婉玉，董 磊，張騰騰，劉 奔，任明芬

(1.新鄉醫學院第二附屬醫院，河南 新鄉 453002；2.新鄉醫學院法醫學院新鄉市法醫毒理學重點實驗室，河南新鄉 453003；3.新鄉醫學院基礎醫學院/河南省醫用組織再生重點實驗室，河南 新鄉 453003)

甲基苯丙胺(methamphetamine，MA)是一種強效的中樞神經系統興奮劑，被列為第一類精神藥物[1]。MA重復攝入易造成藥物成癮，而藥物成癮是一種與獎賞作用和學習記憶有關的慢性復發性腦病[2]，可改變大腦的結構與功能[3]，對各個腦區造成嚴重損害。目前，關于MA成癮的神經毒性機制已經較為明確，但其對心臟的毒性作用及機制尚不明確。條件性位置偏愛(conditioned place preference，CPP)動物模型是用來研究與獎賞相關的學習、記憶功能的經典動物模型[4]，能夠較好地模擬MA成癮者的行為特征[5]，且CPP效應的緩解與成癮性藥物的戒斷治療具有同等效果[6]。本研究擬通過CPP制備MA成癮大鼠模型，觀察MA成癮模型大鼠心臟組織學變化及心肌組織中去甲腎上腺素轉運體(norepinephrine transporter，NET)和多巴胺轉運體(dopamine transporter，DAT)表達的變化，探討MA成癮對大鼠的心臟毒性作用及機制，旨在為進一步研究MA成癮對心臟的毒性作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物無特定病原體級8周齡健康Sprague Dawley(SD)雄性大鼠17只，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2019-0010，體質量230～250 g。對動物的實驗處理方法遵照中華人民共和國科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要試劑與儀器MA購自中國食品藥品檢定研究院(批準文號171212-201605)，NET一抗和DAT一抗購自上海安研商貿有限公司，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒購自武漢賽維爾生物公司，免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物公司；正置光學顯微鏡購自日本Nikon公司，冷凍切片機購自日本Leica公司，CPP實驗視頻分析系統由上海移數信息科技公司提供。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及處理將17只SD大鼠隨機分為對照組(n=7)和MA組(n=10)。2組大鼠均單籠飼養，整個實驗過程自由飲水取食。將MA用生理鹽水配制成5 g·L-1MA溶液。MA組大鼠分別于實驗第 5、7、9、11、13、15、17天腹腔注射5 g·L-1MA溶液(1 mL·kg-1)，第6、8、10、12、14、16、18天腹腔注射生理鹽水(1 mL·kg-1)；對照組大鼠每日腹腔注射生理鹽水(1 mL·kg-1)。

1.3.2 CPP實驗第1～4天為適應期，每日將大鼠放入CPP箱中，將黑白箱中間的隔板取出，讓其在黑白箱中自由活動30 min適應CPP箱環境；然后對每只大鼠進行CPP測試15 min，確定大鼠的天然偏愛箱。第5～18天為訓練期，封閉CPP箱中間的隔板，2組大鼠腹腔注射MA溶液或生理鹽水后放入CPP箱訓練120 min，連續訓練14 d，于第19天對2組大鼠進行CPP測試15 min，記錄大鼠在白箱中停留時間和活動軌跡，分析活動軌跡曲線密度。在每個階段CPP測試過程中，保持安靜，每只大鼠訓練或測試結束后對CPP箱底部及側壁噴灑酒精并清潔，并保證實驗條件、時間、環境的一致。

1.3.3 心臟組織取材和處理實驗第19天，2組大鼠以20 g·L-1的戊巴比妥鈉(60 mg·kg-1)麻醉，然后依次用200 mL生理鹽水和200 mL多聚甲醛溶液(4 g·L-1)行心臟灌流，取左心室，置于4 g·L-1多聚甲醛中室溫固定24 h，使用冰凍切片包埋劑包埋，連續切片(厚 10 μm)，組織切片用于后續HE染色和IHC檢測。

1.3.4 HE染色觀察2組大鼠左心室心肌組織病理學變化冰凍切片45 ℃ 烤片2 h，在搖床上洗5 min 洗去包埋劑。蘇木精染液染色5 min，自來水沖洗多余染色液；然后用體積分數1 %的鹽酸乙醇分化30 s，再用自來水充分洗滌。將組織切片置于體積分數0.5 %的伊紅乙醇溶液中復染2 min，依次在體積分數75 %的乙醇脫水2 min、體積分數85 %的乙醇脫水30 s；再依次在無水乙醇中徹底脫水2次，每次2 min；然后將組織切片依次移入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡各3 min至切片透明，中性樹膠封片。應用正置光學顯微鏡觀察心臟組織的形態學變化。

1.3.5 IHC法檢測2組大鼠左心室心肌組織中NET和DAT的表達取心臟組織冷凍切片，復溫5 min，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)浸洗3次，每次 5 min；用體積分數3%過氧化氫抗原封閉，PBS浸洗3次，每次5 min；室溫下滴加適量的內源性過氧化物酶阻斷劑，孵育10 min，PBS浸洗3次，每次5 min；滴加體積分數5%山羊血清封閉，37 ℃孵育30 min，傾去血清；分別滴加兔抗大鼠多克隆NET一抗(滴度1200)和兔抗大鼠多克隆DAT一抗(滴度1200)，4 ℃過夜。37 ℃恒溫箱復溫30 min，磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered solution，PBST)浸洗3次，每次5 min，滴加山羊抗兔IgG標記的二抗，37 ℃孵育60 min，PBST浸洗3次，每次5 min。使用IHC試劑盒進行染色。使用Image J Basies Version 1.53軟件測量切片陽性免疫反應區域的積分光密度(integral optical density，IOD)值，計算平均光密度值(average optical density，AOD)，AOD=目標分布區域IOD值/目標分布區域的面積，以AOD代表目標物質相對表達量。每只大鼠取3個不同層面的3張切片進行分析，取均值。

2 結果

2.1 2組大鼠白箱中停留時間和活動軌跡曲線密度比較實驗第19天，對照組和MA組大鼠白箱中停留時間分別為(404.478±87.512)、(165.433±27.323)s；MA組大鼠白箱中停留時間顯著長于對照組，差異有統計學意義(t=6.295，P<0.05)。MA組大鼠在白箱中的活動軌跡曲線密度明顯高于前測期，對照組大鼠在白箱中的活動軌跡曲線密度無明顯變化(圖1)。

圖1 2組大鼠CPP測試軌跡圖

2.2 2組大鼠左心室心肌組織病理學變化比較結果見圖2。對照組大鼠左心室心肌細胞排列整齊，未見心肌損傷表現；MA組大鼠左心室心肌細胞排列紊亂，可見心肌組織出血、心肌細胞波紋樣改變、心肌內炎癥細胞聚集。

A:對照組大鼠正常心肌組織；B:MA組大鼠心肌組織內出血；C:MA組大鼠心肌細胞呈波紋樣；D：MA組大鼠心肌組織中可見炎癥細胞。

2.3 2組大鼠左心室心肌組織中NET、DAT相對表達量比較結果見表1和圖3。免疫組織化學染色顯示，NET和DAT陽性表達為棕黃色染色，定位于左心室心肌細胞膜。MA組大鼠左心室心肌組織中NET和DAT相對表達量顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 2組大鼠左心室心肌組織中NET和DAT相對表達量比較

A:對照組大鼠心肌組織中NET的表達；B:MA組大鼠心肌組織中NET的表達；C:對照組大鼠心肌組織中DAT的表達；D：MA組大鼠心肌組織中DAT的表達。

3 討論

MA成癮性強、復吸率高，故其濫用已成為嚴重的公共衛生問題和社會問題[7]。MA是一種間接的擬交感神經藥物[8]，可通過冠狀動脈收縮壓持續升高[9]以及氧自由基大量累積[10]對中樞神經系統和心血管系統產生不良影響。MA對心血管系統造成的毒副作用已成為MA濫用者死亡的重要原因[11]。研究發現，MA成癮對神經系統的影響與大腦中NET和DAT的表達和調控密切相關[12]，但目前MA對心血管系統的影響尚不清楚[13]。

本研究通過給予大鼠MA結合CPP訓練制備MA成癮模型，結果顯示，MA組大鼠在白箱中停留時間顯著長于對照組，MA組大鼠給藥后在白箱中活動軌跡曲線密度明顯高于前測期，而對照組大鼠在白箱中活動軌跡曲線密度無明顯變化；說明MA可以使大鼠產生明顯的CPP效應，對MA產生軀體和精神依賴，證實造模成功。此外，本研究結果顯示，對照組大鼠左心室心肌細胞排列整齊；MA組大鼠左心室心肌細胞排列紊亂，可見心肌出血、心肌細胞波紋樣改變、心肌內炎癥細胞聚集；說明MA可引起大鼠左心室心肌細胞壞死、變性及心肌組織炎癥反應等病理變化，對大鼠心肌組織有一定的損傷作用。

NET可高密度地表達于去甲腎上腺素能神經元質膜上，也表達于膠質細胞中[14]，其通過調節突觸間隙釋放的去甲腎上腺素水平，在許多中樞和外周神經系統生理機制中發揮關鍵作用，NET功能障礙已被證明與注意缺陷多動障礙、恐慌、抑郁癥等多種中樞神經系統疾病相關。在外周神經系統中，NET對心血管穩態至關重要，NET功能障礙通常與高血壓[15]、體位性心動過速綜合征[16]、立位不耐受和心力衰竭[17]等心血管病變中交感神經過度活動有關。DAT可將多巴胺從細胞外迅速轉運到突觸前神經元細胞質中，以維持多巴胺穩態[18]，DAT功能異常參與注意力缺失過動癥、DAT缺乏綜合征、孤獨癥、精神分裂、藥物成癮及帕金森病等多種神經和精神疾病的發生[19]。研究表明，MA和其他精神興奮劑作用于NET和DAT，可破壞去甲腎上腺素和多巴胺的再攝取[20]。本研究結果顯示，對照組和MA組大鼠心肌組織中均有NET、DAT的表達，而MA組大鼠心肌組織中NET、DAT相對表達量顯著低于對照組。這一結果說明，MA成癮可造成心臟組織中NET和DAT表達降低，從而造成對兒茶酚胺的清除減少[12]，導致突觸后兒茶酚胺水平激增，引起血管痙攣、缺血、活性氧產生以及線粒體損傷等，最終造成心肌損傷[21]。有研究報道，靜脈注射三硝基去甲腎上腺素過程中，三硝基去甲腎上腺素在心臟中的分布比例遠遠超過在腎臟、前臂、腿部、大腦和肺部，提示NET功能缺陷可能會增強交感神經化學信號，增加情感性疾病個體心血管疾病發展的風險[22-23]。

綜上所述，MA成癮可通過降低心肌組織中NET和DAT表達水平，導致心肌損傷。但本研究未檢測突觸后兒茶酚胺水平變化，NET和DAT表達變化對突觸后兒茶酚胺水平的確切影響尚未證實，這需在今后的實驗中進行研究；而且未來可對心臟損害和MA用藥時間的關系進行研究，以指導臨床對MA成癮導致的心肌損傷進行預防和治療。