乳腺癌患者血清中B7-同源物2和B7-同源物3的表達及臨床意義

王 璐，劉 敏

(1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；2.南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院腫瘤科，江蘇 蘇州 215000)

乳腺癌作為女性發病率最高的惡性腫瘤，其發病率和病死率仍逐年攀升，嚴重影響患者的生活質量和生命健康。2018年世界衛生組織公布的流行病學調查數據顯示，中國女性乳腺癌發病及死亡的人數居世界前列，分別占全世界女性乳腺癌發病和死亡人數的17.6%和15.6%[1]。隨著對乳腺癌發病機制研究的深入，乳腺癌的診療取得了一定的進展，但仍有3%～10%的患者在首診時即發現肺、骨、腦等遠處轉移，30%的早期患者仍會發展為晚期乳腺癌[2]。轉移或復發的晚期乳腺癌的治療難度大，患者的預后和生活質量較差。隨著乳腺癌免疫學特征研究的深入，免疫治療已成為乳腺癌治療的新熱點。目前，乳腺癌免疫治療研究主要集中在腫瘤疫苗、過繼性免疫細胞療法、免疫檢查點抑制劑，其中，免疫檢查點抑制劑是一個重要的研究方向。盡管針對細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA4)和程序性死亡受體-1(programmed cell death protein-1，PD-1)/程序性死亡配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)的免疫檢查點抑制劑取得重大進展，但是單藥治療乳腺癌的療效有限。因此，提高早期診斷率、尋找腫瘤免疫治療的新靶點的需求越來越迫切。

機體針對腫瘤的免疫應答主要通過活化的T淋巴細胞發揮作用，而T淋巴細胞的活化需要雙重信號的誘導。第一信號是T細胞受體識別由抗原遞呈細胞(antigen presenting cell，APC) 遞呈的主要組織相容性復合體；第二信號即共刺激信號，由APC表面表達的共刺激分子與T細胞上的相應受體作用產生[3]。B7家族是最主要的共刺激分子，B7-同源物2(B7 homolog 2，B7-H2)和B7-同源物3(B7 homolog 3，B7-H3)是新近發現的共刺激分子。研究發現，B7-H2和B7-H3在胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤組織中異常表達，與患者的臨床病理特征及預后相關，認為B7-H2和B7-H3信號通路在腫瘤免疫應答中發揮重要作用[4-8]。本研究旨在通過檢測乳腺癌患者血清中B7-H2、B7-H3的表達，分析其與乳腺癌患者臨床病理特征的關系，為尋找有效的乳腺癌診斷指標及免疫治療靶點提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年1月至2019年6月南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院收治的45例乳腺癌患者為研究對象。病例納入標準：(1)符合乳腺癌相關診斷標準[2]，患者均經手術或穿刺活檢后病理組織學確診；(2)入院前未接受過免疫治療且同意在本院接受治療；(3)臨床資料完整。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)患有嚴重心肺疾病；(3)合并其他免疫性疾病。本研究中45例患者均為女性；年齡24～83(53.60±15.76)歲，≤60歲20例，>60歲25例；腫瘤直徑：≤2 cm者15例，>2 cm者30例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期患者18例，Ⅲ、Ⅳ期患者共27例；浸潤性導管癌34例，其他類型11例；有遠處轉移者13例，無遠處轉移者32例；有淋巴結轉移者24例，無淋巴結轉移者21例；雌激素受體(estrogen receptor，ER)陰性者21例，ER陽性者24例；孕激素受體(progesterone receptor，PR)陰性者28例，PR陽性者17例；人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)陰性者19例，HER-2陽性者26例。另選擇同期在本院體檢中心體檢的25例健康女性作為對照組，年齡21～78(58.84±13.46)歲。2組受試者的年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。研究對象均知情同意并簽署知情同意書，本研究經南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院倫理委員會審查批準。

1.2 血清B7-H2、B7-H3水平檢測抽取2組受試者清晨空腹靜脈血5 mL，置于乙二胺四乙酸處理過的抗凝管中，室溫靜置超過30 min，3 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，置于-70 ℃冰箱保存。采用酶聯免疫吸附法測定血清中B7-H2、B7-H3水平，試劑盒購自蘇州旭光科星生物技術有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 乳腺癌患者臨床資料收集通過查閱病歷收集乳腺癌患者的臨床資料，包括年齡、腫瘤直徑、TNM分期、病理類型、是否有遠處轉移、是否有淋巴結轉移及ER、PR、HER-2表達情況。

2 結果

2.1 2組受試者血清B7-H2、B7-H3 水平比較結果見表1。乳腺癌組患者血清中B7-H2、B7-H3水平顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 2組受試者血清B7-H2、B7-H3 水平比較

2.2 乳腺癌患者血清中B7-H2、B7-H3水平與患者臨床病理特征的關系結果見表2。乳腺癌患者血清B7-H2水平與患者的年齡、腫瘤直徑、TNM分期、病理類型、遠處轉移、淋巴結轉移、ER、PR、HER-2無關(P>0.05)；血清B7-H3水平與患者的TNM分期、遠處轉移、淋巴結轉移有關(P<0.05)，與患者的年齡、腫瘤直徑、病理類型、ER、PR、HER-2無關(P>0.05)。

表2 B7-H2、B7-H3水平與乳腺癌患者臨床病理特征的關系

2.3 乳腺癌患者血清中B7-H2與B7-H3水平的相關性乳腺癌患者血清中B7-H2與B7-H3表達呈正相關(r=0.307，P<0.05)。

2.4 血清B7-H2、B7-H3水平對乳腺癌的診斷價值結果見圖1。B7-H2診斷乳腺癌的AUC為0.866(95%置信區間：0.763～0.935)，最佳截斷值為317.81 μg·L-1，靈敏度為75.6%，特異度為96.0%。 B7-H3診斷乳腺癌的AUC為0.895(95%置信區間：0.799～0.956)，最佳截斷值為49.83 μg·L-1，靈敏度為91.1%，特異度為 84.0%。 B7-H2聯合B7-H3診斷乳腺癌的AUC為0.959(95%置信區間： 0.883～0.952)，靈敏度為93.3%，特異度為88.0%。B7-H2聯合B7-H3診斷乳腺癌的AUC顯著高于B7-H2，差異有統計學意義(Z=2.348，P<0.05);B7-H2聯合B7-H3與B7-H3單獨檢測診斷乳腺癌的AUC比較差異無統計學意義(Z=1.938，P>0.05)，B7-H2與B7-H3單獨檢測診斷乳腺癌的AUC比較差異無統計學意義(Z=0.466，P>0.05)。

圖1 血清B7-H2與B7-H3水平單獨及聯合診斷乳腺癌的ROC曲線

3 討論

乳腺癌已經成為世界范圍內發病率最高的女性惡性腫瘤，是女性惡性腫瘤死亡的首要原因，對女性健康造成極大威脅[1]。2018年美國的一項研究顯示，晚期乳腺癌患者5 a生存率僅為27%[9]。既往乳腺癌被認為是低免疫原性的惡性腫瘤，隨著乳腺癌免疫學研究的不斷深入，有研究指出，乳腺癌具有較高的腫瘤突變負荷(tumor mutation burden，TMB)，TMB越高產生的腫瘤相關抗原越多，作為免疫治療的識別位點就越多[10]。有研究證實，部分乳腺癌高表達PD-L1，PD-L1在三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)中的陽性表達率約為20%，且與TNBC細胞惡性程度呈正相關[11]。亦有研究表明，TNBC和HER-2陽性乳腺癌腫瘤微環境中存在較多的腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)，而PD-L1表達與TILs密度呈正相關[12]。隨著越來越多的研究證實乳腺癌與免疫系統之間的關系，乳腺癌治療也進入了免疫治療階段，其中免疫檢查點抑制劑是研究較為廣泛的一類藥物，包括PD-1/PD-L1抑制劑和CTLA4抑制劑等。就目前臨床試驗結果而言，在乳腺癌患者中應用免疫檢查點抑制劑治療已取得了一定進展，表明利用免疫系統治療乳腺癌的潛力。EMENS等[13]研究顯示，與單藥化學治療組相比，阿特珠單抗聯合白蛋白結合型紫杉醇可顯著延長PD-L1陽性轉移性TNBC患者的無進展生存期及中位生存期，但阿特珠單抗聯合白蛋白結合紫杉醇治療晚期TNBC患者的益處僅見于PD-L1陽性患者。CORTES等[14]研究結果顯示，在PD-L1表達且聯合陽性評分(combined positive score,CPS)≥10的TNBC患者中，帕博利珠單抗聯合化學治療組患者的中位無進展生存期和中位生存期均顯著長于安慰劑聯合化學治療組。基于CORTES 等[14]的研究結果，歐洲藥品管理局批準帕博利珠單抗與化學治療聯合用于表達PD-L1且CPS≥10的轉移性或復發且不可切除的TNBC的一線治療[15]。一項針對激素受體陽性、HER-2陰性的轉移性乳腺癌的多中心Ⅱ期臨床研究中，與艾瑞布林單獨用藥相比，帕博利珠單抗和艾瑞布林聯合用藥組的患者的無進展生存期、總生存期以及客觀反映率并未得到改善[16]。因此，需要尋找新的免疫治療靶點以改善療效不佳、預后較差乳腺癌患者的治療結局。

B7-H2是B7家族第4個成員，又稱為可誘導共刺激分子配體，主要表達于B淋巴細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞等抗原遞呈細胞上，B7-H2的受體是誘導性共刺激分子(inducible costimulatory，ICOS)，僅在活化的T淋巴細胞和記憶T細胞上表達[17]。既往研究表明，B7-H2/ICOS結合可促進CD8+T淋巴細胞增殖和γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)的分泌，從而刺激T淋巴細胞介導的免疫反應，發揮抗腫瘤的作用[18]。但亦有報道證實，B7-H2和ICOS結合參與輔助型T細胞(help T cell，Th)的分化，對Th2增殖及相關細胞因子尤其是白細胞介素(interleukin，IL)-10的釋放有顯著促進作用[19]。對于高表達B7-H2的腫瘤細胞而言，其周圍高濃度的Th2類細胞因子可能對腫瘤細胞的生長起到促進作用，這可能是腫瘤免疫逃逸的機制之一[20]。研究報道，B淋巴細胞上表達的B7-H2與ICOS結合后，既能誘導濾泡Th分泌IL-21，又能促進B細胞分化成漿細胞，進而產生免疫球蛋白，增強體液免疫[21]。有研究報道，B7-H2/ICOS途徑可促進調節性T細胞增殖和IL-10的釋放，進而發揮腫瘤免疫抑制作用[22]。因此，B7-H2通過與ICOS結合在腫瘤的發生和發展中發揮雙重作用。目前，B7-H2在實體瘤中的研究有不少報道，但其對實體瘤的預后評估價值存在一定爭議。KANG等[23]研究顯示，B7-H2通過Janus激酶2/信號轉導和轉錄激活因子3/鋅指轉錄因子Slug信號通路誘導細胞上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)參與肝細胞癌的侵襲和轉移。何樺波等[24]研究顯示，血清中B7-H2在膽囊癌患者中異常高表達，并與膽囊癌患者的臨床病理因素和生存密切相關，B7-H2高表達的患者生存率明顯低于低表達的患者。WANG等[25]研究證實，B7-H2是乳腺癌不良預后的獨立影響因素，但其表達水平與患者年齡、絕經狀態、浸潤深度、淋巴結轉移等臨床病理特征無顯著相關性。但ZHANG等[26]研究顯示， B7-H2高表達的鼻咽癌患者的總生存期和無病生存期顯著延長；多因素分析結果顯示，B7-H2高表達是鼻咽癌的一項獨立預后因素。這種差異性可能與腫瘤類型、研究開始時間及研究方法不同有關。目前已有關于B7-H2在乳腺癌細胞中表達的研究，但關于乳腺癌患者血清中B7-H2的表達研究較少。本研究結果顯示，乳腺癌患者血清中B7-H2表達水平顯著高于對照組，提示其可能參與乳腺癌的發生發展。另外，本研究結果顯示，乳腺癌患者血清中B7-H2表達水平與患者的年齡、腫瘤直徑、TNM分期、病理類型、遠處轉移、淋巴結轉移、ER、PR、HER-2無關，推測可能與乳腺癌高度異質性有關，也有可能與本研究入組患者例數較少有關，有待以后擴大樣本量做進一步分析。

B7-H3又稱為CD276，是一種Ⅰ型跨膜蛋白，主要在活化的T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、樹突狀細胞上表達[27]。因為B7-H3的受體及下游信號傳導通路尚未明確，所以，其在T淋巴細胞介導的腫瘤免疫應答中的作用機制一直存在爭議。早期研究認為，B7-H3是一種共刺激分子，具有促進細胞毒性T淋巴細胞生成和選擇性增強IFN-γ產生的能力[28]。隨后研究發現，B7-H3可通過抑制T細胞增殖和減少IFN-γ、腫瘤壞死因子-α等細胞因子的分泌，導致腫瘤細胞發生免疫逃逸。有研究發現，B7-H3 在原發性乳腺癌中的表達與淋巴管侵襲有顯著相關性，其機制可能是B7-H3通過調控EMT進程，參與細胞的增殖、遷移和侵襲[29]。B7-H3在乳腺癌的發生、發展及轉移方面發揮重要作用，但目前的研究主要集中在B7-H3在乳腺癌組織中的表達，而關于其在血清中表達的相關研究甚少。有研究發現，乳腺癌患者血清中B7-H3表達量與TNM分期、淋巴結轉移以及TILs水平有關[30]。本研究結果顯示，乳腺癌患者血清中B7-H3表達水平高于對照組，與杜貞華等[31]的研究結果一致，提示血清中B7-H3 可能對機體免疫應答起抑制作用，通過促進腫瘤免疫逃逸導致乳腺癌的發生、發展。另外，本研究結果顯示，乳腺癌患者血清中B7-H3水平與患者的TNM分期、遠處轉移、淋巴結轉移有關；B7-H3在TNM分期Ⅰ、Ⅱ期患者血清中的表達水平低于Ⅲ、Ⅳ期患者，提示血清中高表達B7-H3患者往往預后不良；發生淋巴結轉移的乳腺癌患者血清中B7-H3表達水平高于無淋巴結轉移患者，發生遠處轉移的患者血清中B7-H3表達水平高于無遠處轉移的患者，說明隨著癌癥病情逐漸加重，B7-H3表達水平不斷提高，提示B7-H3在血清中的表達水平可反映乳腺癌患者的惡性程度，可作為判斷乳腺癌預后的一個指標。同時，本研究結果顯示，乳腺癌患者血清中B7-H2與B7-H3表達水平呈正相關，提示B7-H2和B7-H3在腫瘤免疫應答中可能存在協同作用，但二者的相互作用有待于進一步研究。

本研究結果顯示，B7-H2診斷乳腺癌的AUC為0.866，靈敏度為75.6%，特異度為96.0%；B7-H3診斷乳腺癌的AUC為0.895，靈敏度為 91.1%，特異度為84.0%；這一結果說明，血清中B7-H2、B7-H3診斷乳腺癌的AUC以及靈敏度和特異度均較高，二者均可協助診斷乳腺癌。本研究結果還顯示，B7-H2 聯合B7-H3診斷乳腺癌的AUC為 0.959，靈敏度為93.3%，特異度為88.0%；說明 B7-H2聯合B7-H3檢測能提高對乳腺癌的診斷效能，這對早期發現乳腺癌有較好的預警作用。

綜上所述，乳腺癌患者血清中B7-H2、B7-H3表達水平與乳腺癌的發生、發展有關，其對腫瘤的免疫應答可能至關重要，有望成為免疫治療的新靶點；且B7-H2、B7-H3對乳腺癌的診斷及預后判斷有潛在的臨床價值。但本研究的樣本量相對較小，未對乳腺癌患者進行生存期隨訪，今后將繼續收集病例并進行生存隨訪，以進一步闡明B7-H2、B7-H3在乳腺癌發生及進展中的作用。