支氣管肺泡灌洗液宏基因組學(xué)二代測(cè)序?qū)η忠u性肺真菌病的診斷價(jià)值

韓李周，靳妍玉

(焦作市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 焦作 454002)

近年來，隨著造血干細(xì)胞移植、放化療、器官移植、免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用，慢性結(jié)構(gòu)性肺病患者和免疫缺陷人群的增多，以及人口老齡化，使侵襲性肺真菌病(invasive pulmonary fungal diseases，IPFD)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。由于IPFD臨床表現(xiàn)缺乏特異性，導(dǎo)致早期診斷較困難。此類疾病進(jìn)展迅速、預(yù)后差，以侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis，IPA)為代表的IPFD病死率可達(dá)50%～100%[2]。為盡早救治、改善預(yù)后，臨床采取分層診治的策略，分為擬診、臨床診斷和確診，對(duì)應(yīng)經(jīng)驗(yàn)性治療、先發(fā)治療和靶向治療。擬診需滿足真菌感染的危險(xiǎn)因素和臨床特征，臨床診斷除前2項(xiàng)外還需要微生物學(xué)證據(jù)，確診必需有組織病理學(xué)證據(jù)[3]。而IPFD患者常因病情危重?zé)o法取得組織病理學(xué)證據(jù)，有時(shí)甚至無微生物學(xué)證據(jù)，給臨床診治帶來挑戰(zhàn)。宏基因組學(xué)二代測(cè)序(metagenomics next-generation sequencing,mNGS)技術(shù)的應(yīng)用為IPFD的診斷打開了突破口。該技術(shù)不依賴樣本鏡檢和微生物培養(yǎng)，允許無差別檢測(cè)樣本中所有微生物的核酸信息，具有高通量和迅速報(bào)告結(jié)果的優(yōu)勢(shì)，有望改變IPFD的傳統(tǒng)診斷模式。本研究回顧性分析焦作市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科采用支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)mNGS檢測(cè)診治的IPFD患者的臨床資料，探討MNGS檢測(cè)的診斷價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2020年5月至2022年5月焦作市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的23例IPFD患者為研究對(duì)象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合IPFD診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，達(dá)到臨床診斷或確診標(biāo)準(zhǔn)；(2)接受支氣管鏡檢查及BALF的傳統(tǒng)微生物學(xué)和mNGS檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<18歲；(2)孕產(chǎn)婦；(3)伴有嚴(yán)重心肺功能不全、不穩(wěn)定心絞痛、高血壓危象、急性腦血管病等不能耐受氣管鏡檢查者；(4)血小板計(jì)數(shù)<20×109L-1者。23例患者中男15例，女8例；年齡24～87歲，中位年齡67歲；有2種以上基礎(chǔ)疾病者15例，1種基礎(chǔ)疾病者7例，無基礎(chǔ)疾病者1例(有潮濕發(fā)霉環(huán)境工作史)。

1.2 病原菌檢測(cè)方法

1.2.1 BALF留取方法BALF的留取參照《肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)(2017年版)》[4]進(jìn)行操作。由臨床醫(yī)生在常規(guī)電子支氣管鏡檢查氣道后，防污染采樣刷檢查前，取60～120 mL無菌生理鹽水灌洗目標(biāo)肺段或亞段，取第2瓶灌洗液送檢mNGS，其余灌洗液進(jìn)行傳統(tǒng)檢測(cè)。

1.2.2 BALF傳統(tǒng)檢測(cè)包括BALF真菌涂片顯微鏡檢查與培養(yǎng)。BALF離心，將沉淀物涂片進(jìn)行顯微鏡檢查。低倍鏡下鱗狀上皮細(xì)胞占全部細(xì)胞(不包括紅細(xì)胞)的比例<1%，柱狀上皮細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例<5%判定為合格標(biāo)本。革蘭染色、抗酸染色、六胺銀染色等處理后行顯微鏡檢查。取100 μL沉淀物混勻后接種于沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。涂片鏡檢與培養(yǎng)結(jié)果一致判定為陽性結(jié)果。

1.2.3 BALF mNGS檢測(cè)將BALF送微遠(yuǎn)基因公司檢測(cè)，分為樣本處理、高通量基因測(cè)序、生物信息分析、報(bào)告解讀等流程。取600 μL肺泡灌洗液(黏稠的樣本加入酶液化液進(jìn)行液化)，使用預(yù)設(shè)的破壁儀程序進(jìn)行破壁處理，然后吸取300 μL，使用微量樣品基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。提取的DNA經(jīng)轉(zhuǎn)座酶建文庫給待測(cè)核酸加上標(biāo)簽序列，制備好的文庫經(jīng)過純化、擴(kuò)增、再純化后，使用Qsep1和Qubit分別對(duì)文庫片段大小和文庫濃度進(jìn)行定量。然后依據(jù)預(yù)設(shè)的上機(jī)數(shù)據(jù)量將文庫進(jìn)行定量混合后，使用美國(guó)illumina公司的Nextseq 550Dx基因測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。去除低質(zhì)量以及長(zhǎng)度小于 40 bp的序列后獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。通過Burrows-Wheeler-Alignment(BWA:http://bio-bwa.sourceforge.net/)軟件將獲得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)與人參考基因序列(hg38)進(jìn)行比對(duì)，去除高質(zhì)量數(shù)據(jù)中的人源序列。剩余的非人源序列在去除低復(fù)雜度序列后與專用的微生物大數(shù)據(jù)庫比對(duì)，并將比對(duì)后的數(shù)據(jù)按照病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲等進(jìn)行分類和排列。序列數(shù)3條以上者為陽性結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2種檢測(cè)方法陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

BALF傳統(tǒng)檢測(cè)檢出煙曲霉1例，白色念珠菌5例，熱帶念珠菌1例，檢測(cè)陽性率為30.43%(7/23)。BALF mNGS檢出耶氏肺孢子菌4例，耶氏肺孢子菌+白色念珠菌3例，耶氏肺孢子菌+煙曲霉1例，耶氏肺孢子菌+熱帶念珠菌+白色念珠菌1例，煙曲霉+黃曲霉2例，黑曲霉1例，煙曲霉+熱帶念珠菌+白色念珠菌1例，白色念珠菌6例，光滑念珠菌1例，新生隱球菌2例，檢測(cè)陽性率為95.65%(22/23)。另外，9例患者合并細(xì)菌感染，1例患者合并結(jié)核分枝桿菌感染。mNGS檢測(cè)的陽性率顯著高于傳統(tǒng)檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.538,P<0.05)；見表1。

表1 23例侵襲性肺真菌病患者BALF病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

IPFD的診斷是臨床難點(diǎn)，痰或BALF涂片與培養(yǎng)、G試驗(yàn)和半乳甘露聚(galactomannan，GM)試驗(yàn)是臨床常用的手段。痰或BALF培養(yǎng)的陽性率較低且耗時(shí)較長(zhǎng)，特殊病理染色(六胺銀染色、過碘酸-雪夫液染色、革蘭染色等)能夠提高診斷率[5]，但受限于檢測(cè)人員的診斷水平。G試驗(yàn)診斷IPA、侵襲性念珠菌病、肺孢子菌肺炎的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值各不相同，且引起假陽性的影響因素眾多[6]。血清GM試驗(yàn)主要用于IPA的診斷，在非粒細(xì)胞缺乏患者并發(fā)IPA中的診斷敏感度較低，陰性預(yù)測(cè)值較高，聯(lián)合BALF GM試驗(yàn)可提高診斷效能[7-8]，在馬爾尼菲青霉菌病的診斷中也具有較大價(jià)值[9]。隱球菌無細(xì)胞壁，無法通過G試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞壁上的1-3-β-D-葡聚糖抗原，常依賴組織病理學(xué)或隱球菌夾膜抗原檢測(cè)[10]。毛霉菌是一種接合菌，細(xì)胞壁不含1-3-β-D-葡聚糖，毛霉菌病的診斷主要依賴組織病理學(xué)，鏡檢常見透明寬大菌絲，少隔或無隔，呈直角或不規(guī)則分支[11]，與曲霉有不同的鏡下特征。在現(xiàn)行的診治策略中G試驗(yàn)與GM試驗(yàn)均不能代替微生物學(xué)或組織病理學(xué)依據(jù)。IPFD常見于免疫力受損患者，就診時(shí)多已存在呼吸功能不全，采用經(jīng)皮肺穿刺、氣管鏡活檢或開胸肺活檢等侵入性方法取組織病理標(biāo)本的風(fēng)險(xiǎn)往往較大，因此確診困難。北京協(xié)和醫(yī)院4.5 a診斷的152例IPFD者中僅38例(25%)取得組織病理學(xué)證據(jù)[12]。因此，臨床亟待新的診斷方法。

氣管鏡肺泡灌洗術(shù)與活檢相比，操作快、風(fēng)險(xiǎn)低。病原宏基因組學(xué)是一種新的不依賴于培養(yǎng)的廣泛分析臨床樣本中微生物組的高通量測(cè)序方法[13]。本研究留取BALF進(jìn)行傳統(tǒng)檢測(cè)與mNGS檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)檢測(cè)對(duì)念珠菌最敏感，曲霉菌次之，而mNGS對(duì)二者均較敏感。耶氏肺孢子菌難以通過培養(yǎng)診斷，常依賴BALF六胺銀染色等檢驗(yàn)技術(shù)[14]，雖常規(guī)送檢BALF六胺銀染色，但本組9例耶氏肺孢子菌肺炎均通過mNGS診斷。XIE等[15]報(bào)道的7例腎移植術(shù)后耶氏肺孢子菌肺炎全部通過BALF或血液 mNGS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其序列確診，提示該方法在耶氏肺孢子菌肺炎的診斷中較敏感。以往認(rèn)為耶氏肺孢子菌肺炎常見于艾滋病患者，本組9例中僅1例證實(shí)為艾滋病患者，8例為風(fēng)濕性多肌痛、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、免疫性血小板減少癥等長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的患者，提示這類免疫受損患者中耶氏肺孢子菌肺炎發(fā)生率并不低，傳統(tǒng)檢查漏診率較高。2例肺隱球菌病經(jīng)mNGS確診，避免了穿刺活檢，亦有文獻(xiàn)報(bào)道通過相同的方法確診肺隱球菌病[16]。1例24歲急性淋巴細(xì)胞白血病患者合并肺毛霉菌病最終依賴CT引導(dǎo)經(jīng)皮肺穿刺活檢確診。但由于肺隱球菌病和肺毛霉菌病的發(fā)病率低、病例數(shù)較少，尚無法評(píng)估m(xù)NGS對(duì)其的診斷價(jià)值。

BALF mNGS的應(yīng)用也受到一些因素的影響。首先是BALF的留取，氣管鏡檢查前清潔患者鼻腔與口腔，氣管鏡檢查時(shí)應(yīng)盡量減少皮膚、鼻腔、上呼吸道菌群的污染，大氣道抽吸物棄去或留作他用，氣管鏡嵌入目標(biāo)肺段取第2瓶灌洗液送檢等[4]。這些細(xì)節(jié)均可能影響檢測(cè)結(jié)果。由于mNGS能無差別地檢測(cè)樣本中的微生物，要求在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)階段即能對(duì)人體皮膚、口腔或上呼吸道微生態(tài)菌群建庫比對(duì)。另外，結(jié)核或某些真菌為胞內(nèi)菌或有夾膜或細(xì)胞壁較厚，核酸提取技術(shù)就顯得尤為重要[17]，不同檢驗(yàn)公司的提取技術(shù)可能有差別。需要指出的是，因?yàn)榻Y(jié)核或某些真菌核酸提取難度大，檢出較少的序列數(shù)也需引起重視。

由于mNGS檢測(cè)無法區(qū)分病原微生物定植與感染，IPED的確診仍需要結(jié)合臨床，尤其是白色念珠菌感染的診斷，因?yàn)槠涫巧虾粑阑蚩谇怀Ｒ姷亩ㄖ簿杈C合考慮患者是否有真菌感染的危險(xiǎn)因素(主要是免疫狀況)、CT影像特征以及G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)等檢驗(yàn)結(jié)果。肺部惡性腫瘤患者下呼吸道可有曲霉和念珠菌的定植，而其他真菌少有定植[18]。除需要考慮上述因素協(xié)診外，筆者認(rèn)為也可以通過DNA與RNA檢測(cè)流程的相互對(duì)照、分析檢出序列數(shù)多少和相對(duì)豐度等協(xié)助判讀。

綜上所述，BALF mNGS檢測(cè)為IPFD的診斷提供了新的快速高效的檢驗(yàn)方法，尤其是耶氏肺孢子菌、曲霉和念珠菌肺炎，對(duì)肺隱球菌病和毛霉菌病的診斷尚需要大樣本研究證實(shí)。該方法至少在“臨床診斷”要求的“微生物學(xué)證據(jù)”層面具有高敏感性的優(yōu)勢(shì)，但能否完全等同于傳統(tǒng)的“微生物學(xué)證據(jù)”，甚至代替“組織病理學(xué)證據(jù)”，目前尚無定論。此外，真菌、細(xì)菌混合感染或不同種類真菌混合感染比較常見，傳統(tǒng)微生物學(xué)檢查漏診較多。總之，該技術(shù)的應(yīng)用正在改變臨床實(shí)踐。