外泌體在慢性乙型肝炎和HBV相關肝細胞癌發生發展中的作用機制

郭紫薇， 陳賀寧， 曹 旭， 張嘉鑫， 張寧怡， 靳 茜， 李小科， 葉永安

1 北京中醫藥大學東直門醫院 脾胃病科， 北京 100700； 2 北京中醫藥大學 第一臨床醫學院， 北京 100029

HBV感染被認為是我國肝細胞癌(HCC)發生發展的主要危險因素，持續的HBV感染會導致慢性乙型肝炎(CHB)并增加終末期肝病包括肝硬化和HCC的風險。因此，HBV感染的早發現、早診斷對于抑制HBV慢性感染，防止CHB進展至HCC具有重要的臨床意義。近年來，外泌體作為一種由細胞分泌的納米級囊泡，以內含豐富核酸、蛋白質和脂類等生物分子為特性，不僅能夠特異性靶向宿主細胞的膜蛋白，啟動下游信號，而且能夠將遺傳物質傳遞到細胞質中，為細胞間通訊提供了另一種途徑，逐漸成為當前各領域的研究熱點。同樣，在HBV感染進展至CHB或HCC的過程中，外泌體充當病毒或腫瘤細胞異質種群與鄰近細胞以及遠處細胞之間交換“貨物”的載體，影響著疾病的進展。迄今為止，外泌體的生理功能仍未完全明確，本文綜述了外泌體的結構、功能及其在HBV感染、HCC進展中的調控機制和信號轉導途徑，希望為今后的CHB和HCC治療方案提供有益線索。

1 外泌體的結構及通訊作用

外泌體于1983年首次在綿羊網織紅細胞中被發現，1987年Johnstone等將其命名為“exosome”[1-2]。現今，其特指由所有真核細胞產生，被雙層脂質膜包裹，直徑在40～100 nm的盤狀囊泡[3]。

外泌體中含有一些重要的生物活性分子，如DNA、RNA、mRNA等。由于其特殊的生成方式，其中含有的細胞質膜、核內體等蛋白質成分要比高爾基體、細胞核、線粒體等相關蛋白質成分多。外泌體還包含主要相容組織復合物(major ribouncleic acid，MHC)；四跨膜蛋白超家族，如CD81、CD82和腫瘤易感基因101(TSG101)等[4]。同時，由于外泌體具有脂質雙分子層，包裹在里面的核酸、蛋白質等生物分子能保持穩定活性，被受體細胞攝取后能夠發揮多方面的生物學作用，如細胞信號傳導、基因調控、免疫調節等。

外泌體主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中，可在血液、尿液和其他體液中檢測到[5-6]。外泌體的主要功能是細胞間通訊，即在鄰近和遠處細胞之間穿梭各種信號分子[7]，如圖1所示。外泌體可以通過未知的受體與靶細胞相互作用，包括位于初級纖毛的受體，并激活下游的細胞內信號通路[8]。它們還可以直接與細胞膜融合，將外泌體膜蛋白整合到質膜上或被內吞，將生物大分子、功能蛋白及核酸運送到受體細胞的細胞質中[9]。因此，外泌體作為細胞與細胞之間物質和信息的“運輸載體”，介導并參與了病毒和宿主細胞的相互作用[10-12]，完成其通訊功能。且在免疫系統中, 外泌體已經被證明在介導適應性和先天性免疫應答中起關鍵作用，通過傳播MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ分子相關的抗原來參與抗原遞呈。

圖1 外泌體通訊作用示意圖

Bukong等[13]從丙型肝炎患者血漿中分離的外泌體中存在HCV RNA，這些外泌體以不依賴受體的方式將HCV傳播給正常肝細胞。這與Dreux等[14]的研究相似，該研究發現HCV RNA被包裹在肝細胞來源的外泌體中，并轉移到漿細胞樣樹突狀細胞中誘導干擾素(IFN)α的產生。早前在單純皰疹病毒的研究[15]中發現，單純皰疹病毒感染細胞分泌的外泌體可將病毒的被膜蛋白和糖蛋白等轉運至未感染的受體細胞, 從而促進潛伏病毒的再激活、擴大病毒的感染、增加組織細胞對單純皰疹病毒的易感性。以上研究均表明外泌體介導病毒細胞間的傳遞，并可作為潛在的免疫逃避或應答機制，在細胞與細胞之間的通信交流方面起著重要的作用。

2 外泌體與HBV感染

全世界大約有2.5億人被HBV感染，持續的HBV感染會導致CHB并增加終末期肝病包括肝硬化和HCC的風險[16-17]。外泌體作為細胞間重要的通訊工具，在參與HBV感染期間的病毒傳播、免疫調節和抗病毒反應中扮演重要角色[18]。然而，已有相關病毒學研究表明，外泌體在HBV感染過程中發揮著“雙刃劍”作用。一方面，病毒可以“挾持”外泌體并將自身攜帶的病毒成分及某些基因編碼蛋白質裝入其中，逃避宿主的免疫應答，促進其在細胞間的傳播。另一方面，宿主細胞也可利用外泌體介導抗病毒通路，傳遞抗病毒因子起到抑制病毒的作用[19]。

2.1 外泌體的促HBV感染作用 由于外泌體的生成過程與許多疾病進展通路有相當大的重疊，所以有相關學者認為病毒可利用外泌體攜帶的病毒RNA、細胞miRNA、蛋白質及其他宿主功能性遺傳元件發揮其信息載體作用介導HBV感染通路，逃避免疫監視而產生感染[20-21]。劉嬌等[22]發現CHB患者血清外泌體與HBV DNA載量密切相關，其中外泌體miR-122隨HBV DNA載量增加而升高，miR-146a水平呈相反趨勢，二者可能拮抗影響HBV DNA復制。聚乙二醇化干擾素α是推薦的抗HBV藥物，然而，其對CHB患者的治療結果仍然不是最佳。四川大學華西醫院團隊[23]下載并分析了對IFNα具有不同反應的CHB患者的基因表達譜，發現先天免疫狀態與CHB患者中基于IFNα的治療反應相關，該研究發現外泌體介導IFITM2向樹突狀細胞的轉運抑制了IFNα合成，導致外源性IFNα處理下的IFN途徑出現了應答障礙，從而抑制外源性IFNα的抗HBV效應，導致HBV持續感染進展至CHB。以上研究提示外泌體可能是HBV傳播的重要調節劑，介導了HBV細胞間的傳播，并可能具有調節先天免疫應答的作用，充當潛在的免疫逃逸機制。其次，有研究表明，HBV可能利用外泌體改變微環境，使其利于病毒的復制和傳播。如Yang等[24]通過熒光電鏡和流式細胞術，發現在CHB患者血清中存在的外泌體同時含有HBV核酸和HBV蛋白，并以主動的方式將HBV轉移到肝細胞。

2.2 外泌體的抗HBV感染作用 作為抵抗病毒感染的主要宿主防御系統，IFN家族可誘導抗病毒基因的表達，如IFNα具有抑制HBsAg和HBV共價閉合環狀DNA的能力，啟動有效的抗病毒反應，因此外泌體可能通過激活人體的免疫功能來應對感染[25]。相關研究[26]表明IFNα可誘導細胞表達人胞苷脫氨酶 (APOBEC3G，A3G) 抵抗HBV的感染。通過熒光標記試驗發現，在IFNα的刺激下，肝非實質細胞能夠通過釋放外泌體，將A3G遞送至被感染的肝實質細胞，恢復肝實質細胞的抗病毒能力[27]。巨噬細胞來源的外泌體利用病毒內吞和胞飲作用將巨噬細胞中與IFNα相關的miRNA轉移到感染HBV的肝細胞中，有效轉移IFNα誘導的抗HBV活性[28]。因此，宿主細胞可通過利用外泌體傳遞抗病毒因子抑制病毒感染[29]。該作用不僅為有效控制肝細胞中HBV的復制提供了應用前景，也暗示了解外泌體的細胞進入機制和途徑有助于將外泌體作為抗病毒治療的有效載體的設想得以實現。

3 外泌體與HCC的發生發展

原發性肝癌是目前我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，其中，HCC 是原發性肝癌最常見的惡性腫瘤。HBV感染是其最主要的危險因素，國內HCC患者HBV感染率高達80%，嚴重威脅我國人民的生命和健康[30]。腫瘤組織不僅包括癌細胞，還包括如癌癥相關成纖維細胞(cancer associated fibroblast, CAF)、內皮細胞、細胞外基質等間質成分在內。HCC細胞與這些間質成分之間相互作用構成了腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)。外泌體攜帶功能活躍的蛋白質、RNA 和其他類型的分子通過改變受體細胞的表型和功能調控著HCC發生發展中的多種信號通路,主要表現為參與癌癥的血管生成、轉移和免疫抑制[31-34]。

3.1 外泌體調節肝癌細胞的生長和轉移 在一項通過觀察20例HBV陽性HCC患者和3例HBV陰性HCC患者中miR-3表達的研究[35]，發現肝組織來源的miR-3在HBV陽性HCC細胞中高表達，而在HBV陰性HCC細胞中不表達，該研究提示在HBV感染者的HCC細胞中，一種HBV編碼的miRNA，即miR-3，被外泌體和HBV核心顆粒釋放到循環中，參與了HCC的發生、發展。研究表明，HCC細胞來源的外泌體介導了HCC細胞與其周圍微環境之間的相互作用，使正常細胞轉化為腫瘤細胞。例如，HCC細胞來源的外泌體向受體細胞傳遞功能性miR-21，導致肝星狀細胞中PDK1/AKT信號的激活。這反過來又將肝星狀細胞轉化為CAF。活化的CAF分泌血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶2(MMP2)、MMP9、堿性成纖維細胞生長因子和TGFβ等細胞因子進一步促進癌癥的發展。此外，含有miR-21和miR-29a的外泌體與免疫細胞中的Toll樣受體結合，激活Toll樣受體中的NF-κB通路，分泌一系列炎癥因子，促進腫瘤生長和轉移[36-38]。除HCC細胞外，其他細胞亦可分泌外泌體促進HCC生長，減少DNA損傷。例如，Zhang等[39]研究證明，脂肪細胞可以通過降低miR-34a和激活USP7/Cyclin A2信號通路在腫瘤生長中釋放出外源性環狀RNA并減少DNA損傷。

3.2 外泌體對肝癌血管生成的影響 HCC是高度血管生成性癌癥，腫瘤的生長需要血管提供各種營養成分。外泌體可通過蛋白質、RNA等調控細胞間通訊，導致腫瘤內異質性的改變，誘導血管管腔形成，最終促進腫瘤細胞的惡性增殖及侵襲性細胞表型的形成。如Lin等[40]研究發現，HCC細胞分泌的外泌體miR-210可通過靶向SMAD4和STAT6轉移至內皮細胞，促進腫瘤血管生成。Yukawa等[41]發現HepG2-exosomes表達免疫細胞的激活受體NKG2D和HSP70 (一種應激相關的熱休克蛋白)，兩者都作用于血管內皮生長因子受體導致血管生成。此外，HCC細胞分泌的外泌體miR-103可通過作用于內皮細胞增加血管通透性，促進肝癌轉移[42]。上海交通大學有相關研究[43]通過蛋白質印跡檢查LOXL4對FAK/Src途徑的影響，發現LOXL4在HCC組織中常被上調，并預測預后不良，升高的LOXL4與腫瘤分化、血管侵襲和腫瘤-淋巴結轉移階段相關。此外，HCC衍生的外泌體通過旁分泌機制將LOXL4轉移至人臍靜脈內皮細胞以促進血管生成。

3.3 外泌體在肝癌免疫中的作用 新的研究證據[44-46]表明，腫瘤來源的外泌體是導致T淋巴細胞功能障礙的主要因素之一，其攜帶多種免疫抑制信號，驅動T淋巴細胞功能障礙以欺騙免疫細胞和逃避免疫監視，實現腫瘤免疫。研究[47]發現，腫瘤來源的外泌體通過刺激巨噬細胞增加IL-1β、IL-6、IL-10 和 TNFα的分泌，激活STAT3途徑并增加其分泌來抑制免疫細胞的活化，從而導致免疫逃逸。此外，CAF通過分泌各種細胞因子、生長因子、趨化因子、外泌體和其他效應分子，與腫瘤浸潤免疫細胞以及TME內的其他免疫成分相互作用，形成免疫抑制性TME，使癌細胞能夠逃避免疫系統監視。對CAF和免疫微環境相互作用的深入研究，特別是將CAF與免疫細胞聯系起來的復雜機制，可能為后續的靶向免疫治療提供新的策略[48-50]。此前，有研究報道肝特異性果糖1,6-雙磷酸酶1(fructose-1, 6-bisphosphatase 1,FBP1) 在HCC組織中普遍受到抑制，其缺失可促進肝臟腫瘤發生并誘導與人類HCC非常相似的代謝和免疫擾動。中山大學Liu等[51]在其研究中使用二乙基亞硝胺誘導HCC小鼠模型，分析了從對照和FBP1耗盡的肝臟中純化的免疫細胞群的潛在變化，報告了FBP1缺陷的肝臟表現出自然殺傷(NK)細胞數量減少和腫瘤發生加速。因此，肝臟FBP1耗竭促進了HCC相關的免疫重塑，部分是通過將肝細胞分泌的、PKLR減弱的細胞外囊泡轉移到NK細胞。這與Kouwaki等[52]的研究相一致，該研究發現HCC中感染的HBV可誘導外泌體miR-21和miR-29，抑制巨噬細胞和樹突狀細胞并釋放 IL-12，IL-12 激活NK細胞，從而破壞先天免疫反應。

4 小結與展望

綜上，在慢性HBV感染中，外泌體既可以包膜的形式轉運肝炎病毒，促進其復制傳播、免疫逃避，也可能成為免疫治療的靶點，介導抗病毒反應。在HCC的發生發展中，一方面，外泌體可通過細胞間通訊促進腫瘤的發生發展、侵襲、轉移，另一方面，也可以攜帶物質進入細胞，作為腫瘤治療藥物的運送載體，從而誘導抗腫瘤免疫反應，或抑制腫瘤細胞來源的外泌體的分泌。因此，外泌體不僅參與了CHB和HCC的發生和發展，還可能為HBV感染相關性肝臟疾病的治療提供新的線索。然而，筆者認為，目前外泌體的分離具有其固有的異質性和生物流體的復雜性，且外泌體在肝臟中的發生、釋放以及與靶細胞相互作用的精確分子機制較少。如何增強外泌體的抗病毒免疫原性、打破免疫耐受、根據TME特點優化現有免疫治療策略、發掘高靈敏度外泌體檢測方法等仍是目前面臨的問題與挑戰。希望在不久的將來，通過深入研究外泌體及外泌體中的內容物，為HBV相關慢性肝炎或HCC提供可靠的早期診斷的生物標志物及特異性的治療靶點。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：郭紫薇、陳賀寧、曹旭負責設計研究，資料分析，撰寫論文；郭紫薇、張嘉鑫、張寧怡、靳茜參與檢索文獻，數據提取，修改論文；李小科、葉永安負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。